In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석

초록

출처: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses(세포 및 유기체 수준 숙주 반응을 조사하기 위한 박테리아 병원체 사용). J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 배양된 대식세포의 in vitro 감염에 따라 세포 내 및 세포 외 병원성 박테리아인 Listeria monocytogenes를 정량화합니다.

프로토콜

1. 유세포 분석(FCM)에 의한 세포 내 및 응급 Lm의 샘플링 처리 및 분석

1. 125mL 플라스크와 37°C/5%_CO2로 유지되는 조직 배양 인큐베이터를 사용하여 10% 태아 송아지 혈청(이하 DMEM/FCS)이 보충된 DMEM 조직 배양 배지에서 마우스 대식세포 유사 세포주 RAW 264.7을 준비합니다. 세포를 1 x 10⁶ cells/mL로 조정하고 1 mL(1 x 10⁶ 세포)를 6-well 조직 배양 접시의 웰에 추가합니다.
2. 리스테리아 모노사이토제네스, Lm, 박테리아 접종을 준비하고 MOI 50(5 x 10⁷ CFU)에 해당하는 접종량으로 세포를 감염시킵니다.
3. 감염 후 1.5시간(hpi)에 첫 번째 웰 세트에서 배지를 수집하고 500μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)가 있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 모든 웰이 처리될 때까지 얼음 위에 놓습니다.
4. 세포 내 Lm을 수집하기 위해 1mL의 ds H₂O를 웰에 첨가하고 60초 후에 생성된 물 용해물을 500μL의 4% PFA가 있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10초 동안 격렬하게 소용돌이치고 모든 우물이 처리될 때까지 얼음 위에 놓습니다.
5. 남은 웰의 경우 배지를 제거하고 1mL의 DMEM/FCS로 5μg/mL 겐타마이신으로 교체하여 세포외 Lm을 죽이고 세포를 즉시 인큐베이터로 되돌립니다.
6. 30분(2hpi) 후 배지를 제거하고 겐타마이신이 없는 DMEM/FCS로 교체합니다.
7. 2시간 및 4시간(4시간 및 6hpi) 후 배지와 용해물을 수집하여 두 번째 및 세 번째 시점을 취합니다.
8. 10,000 x g에서 7분 동안 원심분리기 튜브를 사용합니다.펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.
9. 50μL의 4% PFA와 15μL의 팔로이딘의 염색 칵테일에 각 펠릿을 현탁시킵니다. 4°C의 어두운 곳에서 20분 동안 튜브를 배양합니다.
10. 배양 후 각 튜브와 피펫에 1mL의 FACS 완충액을 첨가하여 혼합합니다.
11. 10,000 x g에서 7분 동안 튜브를 돌립니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거합니다.
12. 즉시 사용을 위해 각 펠릿을 400μL의 FACS 완충액에 현탁하거나, 추후 분석을 위해 보관하는 경우 200μL의 FACS 완충액과 200μL의 4% PFA에 현탁합니다.
13. 유세포 분석에서 샘플을 실행하고 수집된 데이터를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BHI (Brain Heart Infusion) 육수	EMD 밀리포어	110493
셀 스트레이너, 70 μm	폭스바겐	10199-656
콜라겐분해효소 D	로슈	11088858001
DMEM 미디어	지브코	11965-092
FACS 튜브	BD 팔콘	352054
FBS - 열 비활성화	시그마-알드리치	F4135-500ML
행크스의 균형 잡힌 소금 용액	시그마-알드리치	H6648-6X500ML
LB 한천	세포 성장 MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD 고정성 옐로우 데드 셀 스테인 키트	생명 기술	L349S9
로다민 팔로이딘	써모 피셔	R415
SP6800 스펙트럼 분석기	소니
TPP 조직 배양 48웰 플레이트	미시(MIDSCI	TP92048
TPP 조직 배양 6웰 플레이트	미시(MIDSCI	TP92406

년 년 ) )