나노 인젝터를 사용하여 박테리아 현탁액으로 파리를 감염시키는 것

초록

출처: Khalil, S. et al., Drosophila melanogaster의 전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형.J. Vis. 특급(2015년)

이 비디오는 박테리아 현탁액을 파리 체강에 나노 주입하여 박테리아 증식 및 감염을 초래하는 방법을 보여줍니다. 파리의 면역 반응은 일부 박테리아를 제거하는 반면, 다른 박테리아는 면역 제거를 벗어나 숙주 내에서 생존하여 감염을 일으킵니다.

프로토콜

1. 파리 수집 및 준비

1. 원하는 실험 조건 하에서 후방 Drosophila melanogaster. 사육 중 파리가 과도하게 밀집되지 않도록 주의하고 유충 단계의 환경 조건이 성충 단계의 면역 방어 표현형에 깊은 영향을 미칠 수 있으므로 유충 밀도가 치료 전반에 걸쳐 일정한지 확인하십시오.
2. 번데기 케이스에서 eclosion 0 - 3 일 후에 실험용 파리를 수집하고 새로운 배지로 옮깁니다.
3. 수집 된 파리를 원하는 온도 (22 ° C에서 28 ° C 사이의 온도가 일반적으로 적합함)에서 폐쇄 후 5-7 일이 될 때까지 보관합니다 .
   메모: 이것은 파리가 변태를 완료하고 성숙한 성인이 될 수 있는 충분한 시간을 허용하지만 노화가 시작되기 훨씬 전입니다.
4. 감염되기 전에 원하는 수의 파리를 별도의 바이알에 분류하고 다시 한 번 과밀을 피하기 위해 주의하십시오.
   메모: 이 시연에서는 수컷만 감염되지만 설명된 절차를 사용하여 암컷도 똑같이 감염될 수 있습니다.

2. 박테리아 배양 및 준비

1. 감염 최소 2일 전에 선택한 박테리아의 마스터 플레이트를 준비합니다. -80°C에서 무기한 보관된 15% 글리세롤 스톡의 박테리아를 제거합니다. 마스터 플레이트를 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다. 항상 냉동 글리세롤 스톡에서 직접 마스터 플레이트를 줄무늬를 만드십시오. 배양에서 반복적으로 통과하면 박테리아가 약독화 된 독성을 진화시킬 수 있으므로 플레이트에서 플레이트로 박테리아가 연속적으로 통과하지 마십시오.
   메모: 이 예제에서는 Providencia rettgeri 및 Escherichia coli를 사용합니다.
2. 다음 절차를 사용하여 주입을 위한 박테리아 현탁액을 준비합니다.
   1. 마스터 플레이트에서 분리된 단일 콜로니를 멸균 배지에 접종하여 2ml의 박테리아 배양을 성장시킵니다. 박테리아를 고정상(예: 37°C에서 O/N 성장)으로 성장시킵니다.
      메모: P. rettgeri와 E. coli는 모두 20 - 37 °C의 온도에서 부드럽게 흔들면서 Luria Broth에서 잘 자랍니다.
   2. 배양액이 고정기에 도달하면, 탁상용 원심분리기에서 약 600μl의 배양액에서 세포를 부드럽게 펠릿화하고(5,000 x g에서 3분), 상등액을 버리고 약 1,000μl의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS; 137mM 염화나트륨, NaCl, 2.7mM 염화칼륨, KCl, 10 mM 인산 나트륨, Na₂PO₄ , 1.8 mM 인산 이수소 칼륨, KH₂PO₄ , pH = 7.4).
   3. 사용 중인 박테리아에 적합한 광학 밀도(OD)를 얻기 위해 재현탁 세포를 무균 PBS에 희석하고, 600nm에서 분광 광도계로 측정합니다. 이 현탁액을 사용하여 파리를 감염시킵니다.
      메모: A₆₀₀ = 0.1 또는 1.0은 각각 ml당 대략 10,⁸ 및 10,⁹ Providencia rettgeri 또는 E. coli에 해당합니다. 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아 모두 광학 밀도에 기여하기 때문에 박테리아 시체가 축적되어 광학 밀도와 감염 중에 도입된 생존 가능한 박테리아 수 사이의 관계를 왜곡하기 전에 고정상에서 조기에 배양물을 수확하는 것이 중요합니다.

3. 파리 감염

참고: 초파리 면역은 일주기 리듬의 영향을 받기 때문에 실험 복제에서 하루 중 비슷한 시간에 감염을 수행하는 것이 중요합니다.

1. 나노인젝터 사용
   1. 감염에 대비하여 유리 바늘을 준비하십시오.
      1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관을 당겨 유리 바늘을 준비합니다.
      2. 겸자를 사용하여 바늘 끝을 끊어 액체가 배출될 수 있도록 약 50μm 직경의 구멍을 만듭니다.
   2. 인젝터를 조립합니다.
      1. 씰링 O-링을 놓고 흰색 스페이서(바깥쪽을 향한 큰 딤플)를 금속 플런저에 놓습니다.
      2. 30g 바늘이 있는 주사기를 사용하여 유리 바늘에 미네랄 오일을 채웁니다.
      3. 채워진 유리 바늘을 콜릿에 넣은 다음 바늘의 뭉툭한 끝에서 약 1mm 떨어진 바닥 주위에 더 큰 O-링을 놓습니다.
      4. 바늘을 금속 플런저에 밀어 넣고 고정될 때까지 콜릿을 부드럽게 조입니다.
      5. 인젝터에서 대부분의 미네랄 오일을 배출하되 인젝터와 박테리아 현탁액 사이의 장벽 역할을 할 수 있도록 바늘에 여전히 소량의 오일이 있는지 확인하십시오. 미네랄 오일이나 박테리아 현탁액 내부 또는 두 액체 사이에 기포가 없는지 확인하십시오.
      6. 주입기를 원하는 주입 부피(9nl에서 50nl 사이)로 설정합니다.
   3. 부상 컨트롤을 생성합니다.
      1. 모세관 바늘 끝을 매체 튜브에 조심스럽게 삽입하고 주입기의 "채우기" 버튼을 눌러 주입기 바늘에 멸균 PBS를 채웁니다.
         메모: 멸균 박테리아 성장 배지는 실험에서 성장 배지에 부유하는 박테리아를 주입해야 하는 경우 상처 대조군으로도 사용할 수 있습니다. 그러나, 박테리아 성장 배지는 면역 체계를 자극하거나 숙주에 다른 영향을 미칠 수 있는 성분을 함유하고 있기 때문에, PBS와 같은 불활성 담체가 바람직하다.
      2. 가벼운 이산화탄소(CO₂)의 흐름에서 원하는 수의 파리를 마취합니다.
      3. 복부 앞쪽의 파리를 복부 표면의 복부 표면에 멸균 PBS로 주입합니다.
         메모: 흉부의 흉막판과 같은 다른 부위에 파리를 주입하는 것도 가능하지만, 각 실험에서 주입 부위를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.
      4. 주입된 파리를 새 배지가 있는 새 바이알에 넣고 파리가 음식에 달라붙는 것을 방지하기 위해 모든 파리가 마취에서 회복될 때까지 바이알을 옆으로 눕힙니다.
         메모: 두 치료에 동일한 바늘을 사용할 수 있도록 실험용 파리에 박테리아를 주입하기 전에 PBS 대조 파리를 주입하는 것이 좋습니다. 전체 실험에 항상 동일한 바늘을 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 이 경우, 어떤 바늘이 어떤 파리에 사용되었는지 기록하고 바늘 동일성을 통계 분석의 실험 요인으로 포함하는 것이 바람직할 수 있습니다.
   4. 박테리아 병원체를 주입합니다.
      1. 주입기에서 남아 있는 멸균 매체를 꺼내고 동일한 바늘에 박테리아 현탁액을 다시 채웁니다.
      2. 위의 절차(3.1.3)를 반복하여 이제 절차 2.2에서 준비한 박테리아 현탁액을 파리에 주입합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
부 화기	파워스 사이언티픽, Inc	DROS52SD
화필
CO2 플라이패드	플라이스터프	59-114
일산화탄소2	에어가스	CD FG50
초파리 사육 믹스
현미경	올림푸스 주식회사	사이즈51
초파리 바이알 폴리스티렌	VWR 국제	89092-720
Nosterile 대형 면봉	피셔 브랜드	제22-456-883
투명한 뚜껑이 있는 페트리 접시, 융기된 능선; 100 x 15mm;	VWR 국제	제25384-302
LB 한천, 밀러	디프코	244520
접종 루프	VWR 국제	80094-488
다양한 크기의 Rainin Clasic 파이펫 0.1 μl에서 2 μl, 2 μl에서 20 μl, 20 μl에서 200 μl, 100 μl에서 1000	라이닌	PR-2 PR-20 PR-200 홍보-1000
마이크로피펫 팁(다양한 크기)	VWR 국제	30128-376 53503-810 제16466-008
Luria Broth Base, 밀러	디프코	241420
일회용 배양 튜브 붕규산 유리	VWR 국제	제47729-576
S-500 오비탈 셰이커	VWR 국제	제14005-830
원심 분리기	VWR 국제	37001-300
PBS pH 7.4 10배	인비트로젠	70011044
SmartSpec 3000 분광광도계	바이오 라드	170-2501
반마이크로 볼륨 큐벳	바이오 라드	Tel.: 223-9955
수직 모세관 풀러	Kopf 니들 피펫 풀러
3.5'' Nanojet II용 교체용 유리 모세혈관	드러먼드 Sientific Company	3-000-203-G/X
나노젝트 II	드러먼드 Sientific Company	3-000-204
집게	정밀 과학 도구	11255-20
10mL 주사기	BD (영어)	309604
미네랄 오일, 화이트, 라이트	마크롱 정밀 화학	6358-10
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브; 봉인 의식	미국 사이언티픽 Inc.	1615-5500

년 시리즈 호 호 호 호 호 년 년 년 년 년