파리에 전신 세균 감염을 도입하는 패혈성 바늘찌 기술

초록

출처: Khalil, S., et al. Drosophila melanogaster의 전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 병원성 박테리아를 체강에 직접 도입하여 초파리를 감염시키는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 상피 장벽 및 기타 수동적 방어 메커니즘을 우회하여 전신 감염을 유도할 수 있습니다. 감염 시, 파리의 폐사율을 모니터링하고 다운스트림 분석을 수행하여 결과로 발생하는 면역 반응을 평가합니다.

프로토콜

1. 파리 수집 및 준비

1. 원하는 실험 조건에서 후방 D. melanogaster. 사육 중 파리가 과도하게 밀집되지 않도록 주의하고 유충 단계의 환경 조건이 성충 단계의 면역 방어 표현형에 깊은 영향을 미칠 수 있으므로 유충 밀도가 치료 전반에 걸쳐 일정한지 확인하십시오.
2. 번데기 케이스에서 eclosion 0 - 3 일 후에 실험용 파리를 수집하고 새로운 배지로 옮깁니다.
3. 수집 된 파리를 원하는 온도 (22 ° C에서 28 ° C 사이의 온도가 일반적으로 적합함)에서 폐쇄 후 5-7 일이 될 때까지 보관합니다 .
   메모: 이것은 파리가 변태를 완료하고 성숙한 성인이 될 수 있는 충분한 시간을 허용하지만 노화가 시작되기 훨씬 전입니다.
4. 감염되기 전에 원하는 수의 파리를 별도의 바이알에 분류하고 과밀을 피하기 위해 다시 주의하십시오.
   메모: 이 시연에서는 수컷만 감염되지만 설명된 절차를 사용하여 암컷도 똑같이 감염될 수 있습니다.

2. 박테리아 배양 및 준비

1. 감염 최소 2일 전에 선택한 박테리아의 마스터 플레이트를 준비합니다. -80°C에서 무기한 보관된 15% 글리세롤 스톡의 박테리아를 제거합니다. 마스터 플레이트를 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다. 항상 냉동 글리세롤 스톡에서 직접 마스터 플레이트를 줄무늬를 만드십시오. 배양에서 반복적으로 통과하면 박테리아가 약독화 된 독성을 진화시킬 수 있으므로 플레이트에서 플레이트로 박테리아가 연속적으로 통과하지 마십시오.
   메모: 이 예제에서는 Providencia rettgeri 및 Escherichia coli를 사용합니다.
2. 다음 절차를 사용하여 주입을 위한 박테리아 현탁액을 준비합니다.
   1. 마스터 플레이트에서 분리된 단일 콜로니를 멸균 배지에 접종하여 2ml의 박테리아 배양을 성장시킵니다. 박테리아를 고정상(예: 37°C에서 O/N 성장)으로 성장시킵니다.
      메모: P. rettgeri와 E. coli는 모두 20 - 37 °C의 온도에서 부드럽게 흔들면서 Luria Broth에서 잘 자랍니다.
   2. 배양액이 고정기에 도달하면, 탁상용 원심분리기에서 약 600 μl의 배양액에서 세포를 부드럽게 펠릿화하고(5,000 x g에서 3분), 상층액을 버리고 약 1,000 μl의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂PO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH = 7.4).
   3. 사용 중인 박테리아에 적합한 광학 밀도(OD)를 얻기 위해 재현탁 세포를 무균 PBS에 희석하고, 600nm에서 분광 광도계로 측정합니다. 이 현탁액을 사용하여 파리를 감염시킵니다.
      메모: A600 = 0.1 또는 1.0은 각각 ml당 대략 10,⁸ 및 10,⁹ Providencia rettgeri 또는 E. coli에 해당합니다. 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아 모두 광학 밀도에 기여하기 때문에 박테리아 시체가 축적되어 광학 밀도와 감염 중에 도입된 생존 가능한 박테리아 수 사이의 관계를 왜곡하기 전에 고정상에서 조기에 배양물을 수확하는 것이 중요합니다.

3. 파리 감염

참고: 초파리 면역은 일주기 리듬의 영향을 받기 때문에 실험 복제에서 하루 중 비슷한 시간에 감염을 수행하는 것이 중요합니다.

1. 정화조 핀프릭 함유
   1. 찌르기 위해 바늘을 준비합니다.
      1. 200μl 마이크로피펫 팁의 끝을 녹이고 용융된 플라스틱에 0.15mm 곤충 미세먼지 핀을 삽입합니다. 플라스틱에서 뻗어 있는 핀의 약 0.5cm로 핀이 제자리에 고정되도록 플라스틱이 응고되도록 합니다.
   2. 부상 컨트롤을 생성합니다.
      1. CO₂의 가벼운 흐름 아래에서 원하는 수의 파리를 마취합니다.
      2. 바늘로 흉부의 흉흉막판에 있는 파리를 찌르고 날개와 다리의 부착 부위를 피하십시오. 필요한 경우 부드러운 집게를 사용하여 미세한 핀에서 파리를 부드럽게 제거합니다.
         메모: 복측 표면의 전방 복부와 같은 다른 부위에서 파리를 찌르는 것도 가능하지만 각 실험 내에서 주사 부위를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 복부의 표피를 찌르는 것은 흉부를 찌르는 것보다 더 어려운 경향이 있으므로 덜 일반적입니다.
      3. 찔린 파리를 새 파리 배지가 있는 새 유리병에 넣고 파리가 모두 마취에서 회복될 때까지 유리병을 옆으로 눕혀 파리가 음식에 달라붙는 것을 방지합니다.
   3. 세균 감염을 소개합니다.
      1. CO₂의 가벼운 흐름 아래에서 원하는 수의 파리를 마취합니다.
      2. 미디어 컨트롤과 동일한 위치에서 각 플라이를 찌르고 각 플라이를 찌르기 전에 절차 2.2에서 준비된 박테리아 현탁액에 핀 끝을 담그십시오.
      3. 찔린 파리를 새 파리 배지가 있는 새 유리병에 넣고 파리가 모두 마취에서 회복될 때까지 유리병을 옆으로 눕혀 파리가 음식에 달라붙는 것을 방지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
부 화기	파워스 사이언티픽, Inc	DROS52SD
화필
CO2 플라이패드	플라이스터프	59-114
일산화탄소2	에어가스	CD FG50
초파리 사육 믹스
6oz 사각 바닥 병, 폴리프로필렌	제네시 사이언티픽	32-130
Nosterile 특대형 면봉	피셔 브랜드	Tel.: 22-456-882
현미경	올림푸스 주식회사	사이즈51
초파리 바이알 폴리스티렌	VWR 국제	89092-720
Nosterile 대형 면봉	피셔 브랜드	제22-456-883
2L 플라스크	VWR 국제	89000-370
투명한 뚜껑이 있는 페트리 접시, 융기된 능선; 100 x 15mm;	VWR 국제	제25384-302
LB 한천, 밀러	디프코	244520
접종 루프	VWR 국제	80094-488
다양한 크기의 Rainin Clasic 파이펫 0.1 μl에서 2 μl, 2 μl에서 20 μl, 20 μl에서 200 μl, 100 μl에서 1000	라이닌	PR-2 PR-20 PR-200 홍보-1000
마이크로피펫 팁(다양한 크기)	VWR 국제	30128-376 53503-810 제16466-008
Luria Broth Base, 밀러	디프코	241420
일회용 배양 튜브 붕규산 유리	VWR 국제	제47729-576
S-500 오비탈 셰이커	VWR 국제	제14005-830
원심 분리기	VWR 국제	37001-300
PBS pH 7.4 10배	인비트로젠	70011044
SmartSpec 3000 분광광도계	바이오 라드	170-2501
반마이크로 볼륨 큐벳	바이오 라드	Tel.: 223-9955
집게	정밀 과학 도구	11255-20
미네랄 오일, 화이트, 라이트	마크롱 정밀 화학	6358-10
Minutein 핀	정밀 과학 도구	26002-10
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브; 봉인 의식	미국 사이언티픽 Inc.	1615-5500

년 시리즈 호 호 년 호 호 호 호 년 년 년 년 년 년