Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection(대장균 감염 후 Drosophila melanogaster의 대장균 박테리아 부하)

초록

출처: Khalil, S., et al. Drosophila melanogaster의 전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오에서는 Drosophila melanogaster의 흉부에 E. coli를 주입한 후 E. coli 박테리아 부하를 측정하는 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. 감염 후 박테리아 부하 분석

1. 박테리아 부하를 측정합니다.
   1. 주사 후 정해진 시간에 각 파리를 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.
   2. 각 튜브에 250μl PBS를 추가하고 유봉 또는 비드 비터를 사용하여 파리를 균질화합니다.
   3. 나선형 플래터 또는 직렬 희석액을 사용하여 LB 한천 플레이트에 균질액을 플레이트합니다.
      1. 연속 희석을 사용하여 플레이트하려면 각 플라이 균질액을 96웰 플레이트의 첫 번째 행으로 옮깁니다.
      2. 나머지 행의 각 웰에 90μl의 PBS를 채웁니다.
      3. 멀티채널 피펫을 사용하여 플라이 균질액이 포함된 첫 번째 줄에서 10μl를 취하여 두 번째 줄로 분주합니다.
      4. 피펫을 위아래로 10회 이상 주어 완전히 혼합한 다음 10μl를 취하여 세 번째 줄로 옮깁니다. 나머지 행을 사용하여 이 절차를 반복합니다.
      5. 맨 아래 줄(가장 희석된 박테리아 현탁액)에서 시작하여 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10μl를 취하고 LB 플레이트에 침전하고 샘플이 서로 닿지 않는 개별 지점으로 분배되도록 주의합니다. 각 행에서 모든 웰이 샘플링될 때까지 반복하여 LB 플레이트에 희석 내림차순으로 분배합니다.
      6. 얼룩이 LB 플레이트에 완전히 스며들 때까지 플레이트를 RT로 두십시오.
         메모: 액체가 쉽게 흡수되도록 하기 위해 사용하기 전에 RT에서 LB 플레이트를 며칠 동안 건조하는 것이 좋습니다.amp르 스폿 사이의 우발적인 접촉 가능성을 최소화합니다.
   4. O/N 플레이트를 배양하고 플레이트가 과도하게 자라지 않도록 주의하여 군체가 작고 분리된 상태로 유지되도록 합니다.
      메모: 박테리아 성장 배지와 사용된 배양 온도에 따라 파리의 내인성 장내 미생물총(microbiota)에서 파생된 군체가 결국 플레이트에 나타날 수 있습니다. 그러나 병원성 감염에 사용되는 대부분의 박테리아는 37°C에서 LB 한천의 장내 미생물총보다 훨씬 빠르게 성장합니다.
   5. 실험 박테리아가 눈에 보이는 군체가 성장하면(일반적으로 8 - 12시간) 인큐베이터에서 플레이트를 제거하지만, 초파리 장내 미생물 군집이 나타나기 전(약 36시간).천천히 성장하는 실험 박테리아의 경우 LB 한천에 선택적 항생제를 사용하여 장내 미생물총에서 군체를 제거합니다.
   6. 각 균질화에 대한 군체의 수를 세십시오.
      1. 나선형 플레이트의 경우, 플레이트에 있는 콜로니의 수와 위치를 기반으로 균질산염 ml당 박테리아 부하를 추정할 수 있는 자동화된 콜로니 카운터를 사용하여 성장하는 콜로니를 계산합니다.
         참고: 나선형 계수는 박테리아 농도가 ml당 5 x 10²에서 5 x 10⁴ 박테리아 범위일 때 가장 정확합니다.
      2. 스팟 플레이트의 경우, 30 - 300개의 콜로니가 포함된 희석액에서 각 플라이의 콜로니를 수동으로 계산하고 원래 균질산염 ml당 박테리아 수를 계산합니다.
2. 데이터를 분석합니다.
   1. 박테리아 부하가 정규분포가 아닌 경우 정규 분포를 더 잘 근사화하도록 데이터를 변환하거나 비모수 통계 분석(예: Mann-Whitney U 검정)을 사용하여 데이터를 분석합니다. Box-Cox 해석을 사용하여 최적 변환을 찾습니다. 자연 로그 또는 기본 -10 로그 변환이 효과적인 경우가 많습니다.
   2. 데이터가 충분히 정규 분포를 따르고 대조되는 처리가 두 개뿐인 경우 t-검정을 수행하여 두 처리의 평균 박테리아 부하가 다른지 여부를 확인합니다. 여러 실험 변수 또는 기타 잠재적으로 예측 가능한 요인이 있는 경우 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 어떤 요인이 박테리아 부하의 유의한 예측 변수인지 확인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
투명한 뚜껑이 있는 페트리 접시, 융기된 능선; 100 x 15mm;	VWR 국제	제25384-302
LB 한천, 밀러	디프코	244520
접종 루프	VWR 국제	80094-488
1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브; 봉인 의식	미국 사이언티픽 Inc.	1615-5500
전동 유봉; Talboys 실험실 교반기	트로엠너	103
Talboys 고처리량 균질화기	OPS 진단	930145
5/32 "연삭 공	OPS 진단	GBSS 156-5000-01
소용돌이 지니	Scientific indurstries inc.	G560
멀티채널 피펫터(10uL-300uL)	싸토리우스	730360
WASP2 Whitley 자동 나선형 플래터	국제미생물학
ProtoCOL 자동 콜로니 카운터 / 플레이트 카운터 / 플레이트 리더	국제미생물학
부 화기	파워스 사이언티픽, Inc	DROS52SD