배양된 곤충 세포에서 Drosophila C Virus의 바이러스 감염량을 결정하기 위한 분석

초록

출처: Yang, S. et al., Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila melanogaster. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 초파리 S2* 세포에서 초파리 C 바이러스의 조직 배양 감염 바이러스 용량을 결정하기 위한 세포요법 효과 분석을 시연합니다. 배양된 세포를 감염시키기 위해 다양한 바이러스 농도가 사용됩니다. 구조적 변화를 보이는 세포의 비율을 측정하고 이 데이터를 사용하여 조직 배양 감염 선량을 계산합니다.

프로토콜

1. CPE 분석에 의한 초파리 C 바이러스 부하 측정

1. 세포병성 효과(CPE) 분석(TCID₅₀ = 0.7 플라크 형성 단위[PFU]) 1개)에 의한 평균 바이러스 조직 배양 감염 선량(TCID₅₀)을 결정하기 위해 5개의 무작위 바이러스 함유 튜브를 선택합니다.
   메모: CPE는 바이러스 침입으로 인한 숙주 세포의 구조적 변화를 말합니다. 감염 바이러스는 숙주 세포의 용해를 일으키거나 세포가 번식 불능으로 인해 용해되지 않고 죽을 때 발생합니다.
2. 1일차에 피펫팅을 통해 준비된 S2* 세포를 수집합니다. 셀 번호를 세십시오. 세포를 300 x g에서 4분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. S2* 세포를 위한 완전한 배지를 사용하여 세포를 1 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 희석합니다.
3. 웰당 1 x 10⁵ S2*셀(100μL)을 평평한 바닥 96웰 플레이트(~30% 농도)에 파종합니다.
4. S2* 세포에 대한 완전한 배지를 사용하여 DCV 스톡의 연속 10배 희석을 수행합니다. 웰에 50μL 희석액을 추가합니다. 바이러스가 없는 배양 배지 50μL를 음성 대조군 well.
   로 분류된 웰에 추가합니다. 메모: 각 희석 속도에 대해 8개의 웰이 사용되었습니다. 일반적인 DCV 수율은 약 10^{8-10 9} PFU/mL이므로 희석액은 최소한 ~10^{−5-10−10을} 커버해야 합니다.
5. 4일차에는 20X 또는 40X 대물렌즈가 있는 명시야 현미경으로 CPE를 관찰합니다. 세포가 흐릿하게 보이고 매질에 파편이 가득 찬 웰을 "positive well"로, 세포 형태가 정상인 well을 "negative well"로 분류합니다.
6. CPE 양극 또는 음수 웰을 각각 + 또는 –로 표시합니다. Reed and Muench 방법으로 바이러스 TCID₅₀을 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	낙인	352070
10cm 세포 배양 접시	시그마	CLS430167	세포 배양
세포 배양기	산요	미르-553
원심 분리기	에펜도르프	5810R
원심 분리기	에펜도르프	5424R
초파리 인큐베이터	퍼시벌	41NL	초파리 사육
FBS(증권 시세	인비트로젠	제12657-029	세포 배양
슈나이더의 곤충 매체	시그마	S9895	세포 배양
통계 소프트웨어	GraphPad 프리즘 7
평평한 바닥 96웰 플레이트	시그마	CLS3922	세포 배양
세포 배양기	산요	미르-553
현미경	올림푸스	CKX41

표시기 호