Fluorescence Microscopy를 통한 Inflammasome 활성화 검출

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 골수의 수확

1. 마우스에서 대퇴골과 경골을 무균 적으로 제거하고 멸균 기구를 사용하여 뼈를 청소합니다. 세척된 뼈를 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) + 5mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) + 0.2mg/mL L-글루타민 + 0.05mM 2-메르캅토에탄올 + 50mg/mL 겐타마이신 설페이트 + 10,000U/mL 페니실린/스트렙토마이신 + 10% 소 태아 혈청(FBS, DMEM-10 완료)에 넣고 15분 동안 얼음 위에서 튜브를 배양합니다.
2. 가위를 사용하여 근위부 및 원위 볼 조인트를 제거합니다. 배지를 채운 10mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 뼈의 움푹 들어간 곳에 삽입합니다. DMEM-10 complete를 사용하여 골수를 씻어냅니다. 배지를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 덩어리를 다시 부유시킵니다.
3. 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 이 시점에서 90% FBS + 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하여 세포를 동결하거나 15cm 페트리 접시에 세포를 플레이트화하여 L929 조건 배지를 사용하여 대식세포를 구별합니다(2.1단계).

2. 골수 유래 대식세포의 분화

1. 예열된 분화 배지(Swanson 등에 의해 기술된 바와 같이 DMEM-10 complete 21mL 및 L929 세포 조절 배지 9mL)를 사용하여 골수 세포를 15cm 비조직 배양 처리된 페트리 접시(1.2-1.5 x 10⁷ 세포)에 넣습니다. 플레이트를 37°C와 5% 이산화탄소 또는 CO₂에서 7일 동안 배양합니다. 3일차 또는 4일차에 플레이트에 30mL의 분화 배지를 추가로 추가합니다.
   메모: 조직 배양 처리된 플레이트는 대식세포를 분리하고 수확하기 어렵기 때문에 사용하지 않는 것이 중요합니다.
2. 대식세포를 수집하려면 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 세척하고 차가운 PBS + 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 20mL를 추가합니다. 플레이트를 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 세포 위에 PBS + EDTA를 피펫팅하고 10mL의 PBS로 플레이트를 세척하여 세포를 수확합니다. 두 세척제를 두 개의 15mL 코니컬 튜브에 결합합니다.
3. 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 10mL의 페놀-레드 프리 DMEM + 5mM HEPES + 0.2mg/mL L-글루타민 + 0.05mM 2-메르캅토에탄올 + 5% FBS(DMEM-5)에 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 쿨터 카운터를 사용하여 세포를 계수합니다. 계수하는 동안 세포를 얼음 위에 두십시오.
4. 조직 배양 코팅된 플레이트에 대식세포를 2 x 10⁵ cells/mL로 파종합니다. 현미경 실험의 경우, 24개의 웰 플레이트에 있는 커버슬립에 1mL의 세포를 시딩합니다. LDH(lactate dehydrogenase) 방출 분석의 경우 96웰 플레이트에 100μL의 세포를 시딩합니다. LDH 분석의 경우 9개의 웰(처리되지 않은 3개의 웰, 100% 용해 제어가 있는 3개의 웰, 실험적 자극을 위한 3개의 웰
)을 시드합니다.
5. 96웰 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
6. 프라이밍 과정을 시작하기 전에 37 ° C + 5 % CO₂에서 밤새 플레이트를 배양하십시오.

3. 프라이밍

1. 배지를 100ng/mL 지질다당류 또는 LPS(24웰 플레이트의 경우 500μL 또는 96웰 플레이트의 경우 50μL)를 함유한 새 배지(DMEM-5)로 교체합니다.
   메모: LPS에는 TLR4 매개 프라이밍을 자극하는 능력에 영향을 미치는 다양한 구조적 변형이 있습니다. Salmonella minnesota R595(Re)의 LPS는 여러 공급업체에서 구할 수 있으며 권장됩니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다.

4. 니게리신을 이용한 NLRP3 인플라마솜 활성화 및 FAM-YVAD-FMK를 사용한 라벨링

1. 배지를 제거하고 5μM 니게리신과 5mM 글리신을 함유한 290μL의 DMEM-5로 교체합니다. 글리신은 카스파제-1 활성화 중에 발생하는 세포 용해의 양을 줄이기 위해 첨가됩니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 60 분 동안 배양합니다. 야생형 대식세포와 카스파제-1 결핍 대식세포를 모두 사용하여 관찰된 표지가 카스파제-1에 특이적인지 확인합니다.
2. 마지막 45분 동안 제조업체의 지침에 따라 준비된 10μL의 30x FAM-YVAD-FMK를 추가합니다.
3. 60분 후 배지를 제거하고 차가운 PBS 1mL로 각각 5분씩 세포를 3회 세척합니다.
4. 각 웰에 250μL의 2% 파라포름알데히드를 추가하고 알루미늄 호일로 덮인 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
5. 마지막 5분 동안 0.2mM 원적색 형광 핵산 염색 4μL를 추가하여 핵을 라벨링합니다. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 또는 기타 염료를 사용하여 DNA를 라벨링할 수도 있습니다.
6. 1mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척하고 7μL 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착합니다. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 밀봉하기 전에 장착 매체를 밤새 굳히십시오.
7. 컨포칼 현미경으로 대식세포를 이미지화합니다. FAM-YVAD-FMK의 Ex/Em은 492/520nm이고 원적외 형광 핵산 염색의 경우 642/661입니다. 처리되지 않은 세포가 488 채널에서 배경 염색을 보이지 않도록 현미경을 설정해야 합니다. 그렇지 않으면 background FAM-YVAD-FMK 염색이 검출되고 실제 활성 caspase-1이 검출되지 않습니다.

5. 컨포칼 현미경 검사법에 의한 표지된 대식세포의 이미징

참고: 염색된 세포는 커버슬립이 하룻밤 동안 경화되고 매니큐어로 현미경 슬라이드에 밀봉된 후에 볼 수 있습니다. 여기에서는 컨포칼 현미경을 사용한 이미징에 대해 설명합니다. 표준 형광 현미경 검사로도 세포를 볼 수 있습니다.

1. 처리되지 않은 대조군 세포가 있는 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 현미경을 세포에 초점을 맞춥니다.
2. 현미경 LUT(Look Up Table) 설정을 사용하여 처리되지 않은 세포에 양성 FAM-YVAD-FMK 염색이 없도록 오프셋을 조정합니다. 이 프로세스는 caspase-1 결핍 대식세포를 사용하여 수행할 수도 있습니다.
   메모: 실험에 사용된 각 채널에 대해 오프셋을 조정해야 하지만 FAM-YVAD-FMK 채널 및 형광 항체 채널에 대해 올바른 오프셋을 설정하는 것이 가장 중요합니다. DNA 채널의 오프셋은 덜 중요합니다. 오프셋이 설정되면 나머지 실험에 대해 이 설정을 조정하지 마세요.
3. 슬라이드를 니게리신으로 처리된 샘플로 전환합니다. FAM-YVAD-FMK 염색에 대해 양성 및 음성 세포를 모두 포함하는 필드를 찾습니다. FAM-YVAD-FMK 채널의 이미징 평면을 양성 염색 강도가 가장 높은 평면으로 조정합니다. 이것은 일반적으로 인플라마솜 초점의 중심이 이미지화되는 평면입니다.
4. 집약된 핵이 있는 세포에서 초점이 보이도록 이득을 조정합니다. 게인과 오프셋을 모두 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분 동안 이 설정을 그대로 둡니다.
   메모: 세포가 발열성인지 확인하는 한 가지 쉬운 방법은 핵 형태학을 살펴보는 것입니다. 활성 카스파제-1이 있는 세포는 둥글고 응축된 핵을 가지고 있는 반면, 핵은 카스파제-1이 활성화되지 않은 세포에서 볼 수 있으며 핵 형태는 처리되지 않은 세포와 유사합니다.
5. 무작위로 선택된 5개의 필드에 대한 이미지를 총 배율 100배로 수집합니다. 이렇게 하면 일반적으로 이미지당 약 40개의 셀이 생성됩니다. 각 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다.
6. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 FAM-YVAD-FMK 염색이 양성인 세포의 수를 계산합니다. 카스파제-1 활성화 수준을 FAM-YVAD-FMK 양성 세포의 백분율로 나타냅니다.