동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 골수의 수확
- 마우스에서 대퇴골과 경골을 무균 적으로 제거하고 멸균 기구를 사용하여 뼈를 청소합니다. 세척된 뼈를 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) + 5mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) + 0.2mg/mL L-글루타민 + 0.05mM 2-메르캅토에탄올 + 50mg/mL 겐타마이신 설페이트 + 10,000U/mL 페니실린/스트렙토마이신 + 10% 소 태아 혈청(FBS, DMEM-10 완료)에 넣고 15분 동안 얼음 위에서 튜브를 배양합니다.
- 가위를 사용하여 근위부 및 원위 볼 조인트를 제거합니다. 배지를 채운 10mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 뼈의 움푹 들어간 곳에 삽입합니다. DMEM-10 complete를 사용하여 골수를 씻어냅니다. 배지를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 덩어리를 다시 부유시킵니다.
- 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 이 시점에서 90% FBS + 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 사용하여 세포를 동결하거나 15cm 페트리 접시에 세포를 플레이트화하여 L929 조건 배지를 사용하여 대식세포를 구별합니다(2.1단계).
2. 골수 유래 대식세포의 분화
- 예열된 분화 배지(Swanson 등에 의해 기술된 바와 같이 DMEM-10 complete 21mL 및 L929 세포 조절 배지 9mL)를 사용하여 골수 세포를 15cm 비조직 배양 처리된 페트리 접시(1.2-1.5 x 107 세포)에 넣습니다. 플레이트를 37°C와 5% 이산화탄소 또는 CO2에서 7일 동안 배양합니다. 3일차 또는 4일차에 플레이트에 30mL의 분화 배지를 추가로 추가합니다.
메모: 조직 배양 처리된 플레이트는 대식세포를 분리하고 수확하기 어렵기 때문에 사용하지 않는 것이 중요합니다.
- 대식세포를 수집하려면 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 세척하고 차가운 PBS + 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 20mL를 추가합니다. 플레이트를 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 세포 위에 PBS + EDTA를 피펫팅하고 10mL의 PBS로 플레이트를 세척하여 세포를 수확합니다. 두 세척제를 두 개의 15mL 코니컬 튜브에 결합합니다.
- 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 10mL의 페놀-레드 프리 DMEM + 5mM HEPES + 0.2mg/mL L-글루타민 + 0.05mM 2-메르캅토에탄올 + 5% FBS(DMEM-5)에 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 쿨터 카운터를 사용하여 세포를 계수합니다. 계수하는 동안 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 조직 배양 코팅된 플레이트에 대식세포를 2 x 105 cells/mL로 파종합니다. 현미경 실험의 경우, 24개의 웰 플레이트에 있는 커버슬립에 1mL의 세포를 시딩합니다. LDH(lactate dehydrogenase) 방출 분석의 경우 96웰 플레이트에 100μL의 세포를 시딩합니다. LDH 분석의 경우 9개의 웰(처리되지 않은 3개의 웰, 100% 용해 제어가 있는 3개의 웰, 실험적 자극을 위한 3개의 웰
)을 시드합니다.
- 96웰 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
- 프라이밍 과정을 시작하기 전에 37 ° C + 5 % CO2에서 밤새 플레이트를 배양하십시오.
3. 프라이밍
- 배지를 100ng/mL 지질다당류 또는 LPS(24웰 플레이트의 경우 500μL 또는 96웰 플레이트의 경우 50μL)를 함유한 새 배지(DMEM-5)로 교체합니다.
메모: LPS에는 TLR4 매개 프라이밍을 자극하는 능력에 영향을 미치는 다양한 구조적 변형이 있습니다. Salmonella minnesota R595(Re)의 LPS는 여러 공급업체에서 구할 수 있으며 권장됩니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
4. 니게리신을 이용한 NLRP3 인플라마솜 활성화 및 FAM-YVAD-FMK를 사용한 라벨링
- 배지를 제거하고 5μM 니게리신과 5mM 글리신을 함유한 290μL의 DMEM-5로 교체합니다. 글리신은 카스파제-1 활성화 중에 발생하는 세포 용해의 양을 줄이기 위해 첨가됩니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 60 분 동안 배양합니다. 야생형 대식세포와 카스파제-1 결핍 대식세포를 모두 사용하여 관찰된 표지가 카스파제-1에 특이적인지 확인합니다.
- 마지막 45분 동안 제조업체의 지침에 따라 준비된 10μL의 30x FAM-YVAD-FMK를 추가합니다.
- 60분 후 배지를 제거하고 차가운 PBS 1mL로 각각 5분씩 세포를 3회 세척합니다.
- 각 웰에 250μL의 2% 파라포름알데히드를 추가하고 알루미늄 호일로 덮인 얼음에서 30분 동안 배양합니다.
- 마지막 5분 동안 0.2mM 원적색 형광 핵산 염색 4μL를 추가하여 핵을 라벨링합니다. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 또는 기타 염료를 사용하여 DNA를 라벨링할 수도 있습니다.
- 1mL의 차가운 PBS로 세포를 세 번 세척하고 7μL 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착합니다. 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 밀봉하기 전에 장착 매체를 밤새 굳히십시오.
- 컨포칼 현미경으로 대식세포를 이미지화합니다. FAM-YVAD-FMK의 Ex/Em은 492/520nm이고 원적외 형광 핵산 염색의 경우 642/661입니다. 처리되지 않은 세포가 488 채널에서 배경 염색을 보이지 않도록 현미경을 설정해야 합니다. 그렇지 않으면 background FAM-YVAD-FMK 염색이 검출되고 실제 활성 caspase-1이 검출되지 않습니다.
5. 컨포칼 현미경 검사법에 의한 표지된 대식세포의 이미징
참고: 염색된 세포는 커버슬립이 하룻밤 동안 경화되고 매니큐어로 현미경 슬라이드에 밀봉된 후에 볼 수 있습니다. 여기에서는 컨포칼 현미경을 사용한 이미징에 대해 설명합니다. 표준 형광 현미경 검사로도 세포를 볼 수 있습니다.
- 처리되지 않은 대조군 세포가 있는 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 현미경을 세포에 초점을 맞춥니다.
- 현미경 LUT(Look Up Table) 설정을 사용하여 처리되지 않은 세포에 양성 FAM-YVAD-FMK 염색이 없도록 오프셋을 조정합니다. 이 프로세스는 caspase-1 결핍 대식세포를 사용하여 수행할 수도 있습니다.
메모: 실험에 사용된 각 채널에 대해 오프셋을 조정해야 하지만 FAM-YVAD-FMK 채널 및 형광 항체 채널에 대해 올바른 오프셋을 설정하는 것이 가장 중요합니다. DNA 채널의 오프셋은 덜 중요합니다. 오프셋이 설정되면 나머지 실험에 대해 이 설정을 조정하지 마세요.
- 슬라이드를 니게리신으로 처리된 샘플로 전환합니다. FAM-YVAD-FMK 염색에 대해 양성 및 음성 세포를 모두 포함하는 필드를 찾습니다. FAM-YVAD-FMK 채널의 이미징 평면을 양성 염색 강도가 가장 높은 평면으로 조정합니다. 이것은 일반적으로 인플라마솜 초점의 중심이 이미지화되는 평면입니다.
- 집약된 핵이 있는 세포에서 초점이 보이도록 이득을 조정합니다. 게인과 오프셋을 모두 설정한 후 이미징 세션의 나머지 부분 동안 이 설정을 그대로 둡니다.
메모: 세포가 발열성인지 확인하는 한 가지 쉬운 방법은 핵 형태학을 살펴보는 것입니다. 활성 카스파제-1이 있는 세포는 둥글고 응축된 핵을 가지고 있는 반면, 핵은 카스파제-1이 활성화되지 않은 세포에서 볼 수 있으며 핵 형태는 처리되지 않은 세포와 유사합니다.
- 무작위로 선택된 5개의 필드에 대한 이미지를 총 배율 100배로 수집합니다. 이렇게 하면 일반적으로 이미지당 약 40개의 셀이 생성됩니다. 각 샘플에 대해 이 과정을 반복합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 이미지의 세포 수를 계산합니다. 그런 다음 FAM-YVAD-FMK 염색이 양성인 세포의 수를 계산합니다. 카스파제-1 활성화 수준을 FAM-YVAD-FMK 양성 세포의 백분율로 나타냅니다.
