$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 골수 유래 대식세포의 분화
- 예열된 분화 배지(Swanson 등에 의해 기술된 바와 같이 DMEM-10 complete 21mL 및 L929 세포 조절 배지 9mL)를 사용하여 골수 세포를 15cm 비조직 배양 처리된 페트리 접시(1.2-1.5 x 107 세포)에 넣습니다. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO2에서 7 일 동안 배양합니다. 3일차 또는 4.
일에 플레이트에 30mL의 분화 배지를 추가로 추가합니다.
메모: 조직 배양 처리된 플레이트는 대식세포를 분리하고 수확하기 어렵기 때문에 사용하지 않는 것이 중요합니다.
- 대식세포를 수집하려면 인산염 완충 식염수(PBS)로 플레이트를 세척하고 차가운 PBS + 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 20mL를 추가합니다. 플레이트를 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 세포 위에 PBS + EDTA를 피펫팅하고 10mL의 PBS로 플레이트를 세척하여 세포를 수확합니다. 두 세척제를 두 개의 15mL 코니컬 튜브에 결합합니다.
- 300 x g에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 10mL의 페놀-레드 프리 DMEM + 5mM HEPES + 0.2mg/mL L-글루타민 + 0.05mM 2-메르캅토에탄올 + 5% FBS(DMEM-5)에 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 쿨터 카운터를 사용하여 세포를 계수합니다. 계수하는 동안 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 조직 배양 코팅된 플레이트에 대식세포를 2 x 105 cells/mL로 파종합니다. 현미경 실험의 경우, 24개의 웰 플레이트에 있는 커버슬립에 1mL의 세포를 시딩합니다. LDH 방출 분석의 경우 96웰 플레이트에 100μL의 세포를 시딩합니다. LDH 분석의 경우 9개의 웰(처리되지 않은 3개의 웰, 100% 용해 제어가 있는 3개의 웰, 실험적 자극을 위한 3개의 웰
)을 시드합니다.
- 96웰 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
- 프라이밍 과정을 시작하기 전에 37 ° C + 5 % CO2에서 밤새 플레이트를 배양하십시오.
2. 프라이밍
- 배지를 100ng/mL LPS(24웰 플레이트의 경우 500μL 또는 96웰 플레이트의 경우 50μL)를 포함하는 새 배지(DMEM-5)로 교체합니다.
메모: LPS에는 TLR4 매개 프라이밍을 자극하는 능력에 영향을 미치는 다양한 구조적 변형이 있습니다. Salmonella minnesota R595(Re)의 LPS는 여러 공급업체에서 구할 수 있으며 권장됩니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
3. Nigericin을 사용한 NLRP3 Inflammasome의 활성화
- 배지를 제거하고 5μM 니게리신과 5mM 글리신을 함유한 290μL의 DMEM-5로 교체합니다. 글리신은 카스파제-1 활성화 중에 발생하는 세포 용해의 양을 줄이기 위해 첨가됩니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 60 분 동안 배양합니다. 야생형 대식세포와 카스파제-1 결핍 대식세포를 모두 사용하여 관찰된 표지가 카스파제-1에 특이적인지 확인합니다.
- 60분 후 배지를 제거하고 차가운 PBS 1mL로 각각 5분씩 세포를 3회 세척합니다.
4. 항체 염색
참고: ASC를 검출하기 위해 세포에 항체를 표시하고, 세포를 시드, 프라이밍 및 이전 섹션과 동일한 nigericin에 노출시킵니다. 이후 처리는 다음과 같습니다.
- 차가운 PBS 1mL로 각각 5분씩 세포를 세 번 세척합니다. 250μL의 고정 및 투과화 용액을 추가합니다. 얼음 위에서 세포를 배양하고 30분 동안 덮습니다.
- 대식세포를 세척 완충액 1mL로 5분씩 3회 세척합니다.
- 세척 버퍼에 1:500으로 희석된 ASC에 대한 1차 항체 250μL를 추가하고 얼음에서 1시간 동안 배양합니다. 1차 항체를 받지 않고 2차 항체만 받는 커버슬립 하나를 포함합니다. 이 커버슬립은 현미경 설정 중에 올바른 오프셋을 설정하는 데 사용됩니다.
- 1mL 세척 버퍼로 각각 5분씩 세포를 세 번 세척합니다.
- 세척 완충액에 1:500으로 희석된 250μL의 2차 항체(형광 염료, 접합 염소-항-마우스)를 추가하고 얼음에서 1시간 동안 배양합니다. 이 배양의 마지막 5분 동안 0.2mM 원적색 형광 핵산 염색 4μL를 추가하여 핵을 표지합니다.
- 1mL의 냉세척 버퍼로 셀을 3회 세척하고 7μL 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착합니다. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 밀봉하기 전에 장착 매체를 밤새 굳히십시오.
- 컨포칼 현미경 검사법에 의한 이미지 대식 세포. 2차 항체에 대한 Ex/Em은 555/580 nm이고 원적외 형광 핵산 염색에 대한 642/661입니다.