Nigericin 노출 후 대식 세포 사멸을 감지하기 위한 Lactate Dehydrogenase 방출 분석

초록

출처: den Hartigh, A.B. et al., 쥐 골수 유래 대식세포에서 인플라마솜 활성화 및 발열 세포 사멸 검출. J. Vis. 특급 (2018)

이 동영상은 인플라마좀에 의한 대식세포 사멸을 검출하기 위한 젖산 탈수소효소 분석을 보여줍니다. 대식세포는 프라이밍을 위해 지질다당류에 노출된 후 니제리신에 노출되어 인플라마좀에 의한 세포 사멸을 유발하며, 이는 젖산 탈수소효소 분석에 의해 결정됩니다.

프로토콜

1. LDH 방출 분석

참고: LDH 방출 분석의 경우 세포를 96웰 플레이트에 시딩합니다. 프라이밍 후 매체를 제거하지 마십시오.

1. 배지를 부착성 대식세포 세포(24웰 플레이트의 경우 500μL 또는 96웰 플레이트의 경우 50μL)를 포함하는 웰에서 100ng/mL LPS를 포함하는 새로운 배지(DMEM-5: 페놀-레드 프리 DMEM 10mL + 5mM HEPES + 0.2mg/mL L-글루타민 + 0.05mM 2-메르캅토에탄올 + 5% FBS)로 교체합니다.
   메모: LPS에는 TLR4 매개 프라이밍을 자극하는 능력에 영향을 미치는 다양한 구조적 변형이 있습니다. Salmonella minnesota R595(Re)의 LPS를 권장합니다.
2. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 10μM 니제리신을 함유한 DMEM-5 50μL를 실험 웰에 첨가하고 50μL DMEM-5를 자연 및 100% 용해 대조 웰에 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 60 분 동안 배양합니다.
4. 30분 후 100% 용해 제어 웰에 10μL의 10x 용해 완충액을 추가하고 다른 웰에 10μL의 DMEM-5를 추가합니다. 이 배양 중에 냉동고에서 기질 혼합물 1바이알(동결 건조 기질 1.5mL)과 분석 완충액 분취액 1개(~12mL)를 제거하고 빛으로부터 실온까지 보호된 상태로 해동합니다.
   메모: 기질 혼합물에는 테트라졸륨 염(iodonitrotetrazolium violet)이 포함되어 있으며, 이는 적색 포르마잔 생성물로 전환됩니다.
5. 60분 총 배양 후 10°C에서 500 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다.상등액 50μL를 투명하고 평평한 바닥 플레이트로 옮깁니다. 이 시간 동안 기질 혼합물 바이알에 12mL의 분석 버퍼를 추가하고 사용하기 전에 실온에서 5분 동안 배양합니다.
6. 각 웰에 50μL의 기질을 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 빈 값에 대해 중간 전용 well을 포함합니다. 15분 후에 플레이트를 점검하여 신호가 플레이트 리더의 감지 한계를 초과하지 않는지 확인하십시오.
7. 30분 후 50μL의 정지 용액(1M 아세트산)을 추가하고 플레이트 리더를 사용하여 OD₄₉₀을 측정합니다.
8. 다음 공식을 사용하여 세포 용해 비율을 계산합니다.
   % 세포 독성 = ((실험적 - 자발적)/(최대 - 자발적)))×100
   실험적: 니게리신 처리된 세포; 자발적: 처리되지 않은 세포; 최대: 용해 완충액에 노출된 세포.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cytotox96 비방사성 세포독성 분석	피셔 사이언티픽	PR-G1780	기질 혼합 및 분석 버퍼를 포함합니다. 독점 제형. 정지 용액은 1M 아세트산입니다.
DMEM, 고포도당, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음	인비트로젠	31053028
Dulbecco의 PBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	인비트로젠	14190144
소 태아 혈청, 유자격, 미국 원산지	인비트로젠	26140079	55°C에서 50분 동안 가열 비활성화
겐타마이신	인비트로젠	15750060
살모넬라 미네소타 R595의 초순수 LPS(Re)	생물학적 제제 목록	434
Spectramax M3 플레이트 리더	분자 장치	5000414
L-글루타민	인비트로젠	21051024

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