Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

초록

출처: Arends, E. J. et al., 호중구 세포 외 트랩 형성을 평가하고 정량화하기 위한 고처리량 분석.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 건강한 호중구의 분리

1. 건강한 기증자로부터 10mL 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 코팅 튜브 2개에서 말초 혈액 20mL를 채취합니다.
2. 멸균된 50mL 튜브에 혈액 10mL를 넣고 인산염 완충 식염수(PBS)를 최대 32.5mL까지 추가합니다.
3. 세포 아래에 밀도 구배(예: Ficoll-amidotrizoaat)를 추가합니다.
   1. 10 mL 피펫 및 피펫 컨트롤러로 14 mL의 밀도 구배를 흡수합니다.
   2. 50mL 튜브 바닥에 피펫을 놓습니다.
   3. 피펫 컨트롤러를 피펫에서 분리하여 모터를 사용하지 않고 모세관 효과(1-2mL가 남음)에 의해 최대치에 도달할 때까지 중력에 의해 밀도 구배가 피펫 밖으로 흘러나오도록 합니다.
   4. 피펫 위에 엄지 손가락을 올려 피펫을 제거하여 피펫을 제거하는 동안 밀도 구배가 누출되는 것을 방지합니다.
4. 가속이나 제동 없이 912 x g 및 실온(RT)에서 20분 동안 튜브를 돌립니다.
   참고: 적혈구(RBC)와 호중구는 밀도가 높으며 50mL 튜브의 맨 아래에 있습니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 분리되어 밀도 구배 위에 흰색 고리로 표시됩니다. PBS 희석 플라즈마는 PBMC 위에 있습니다. 필요한 경우, 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용한 추가 세척 단계를 통해 흰색 고리를 새로운 50mL 튜브로 옮겨 PBMC를 분리할 수 있습니다.
5. 먼저 PBMC가 포함된 흰색 고리를 조심스럽게 제거한 다음 PBS 희석된 플라즈마를 제거하고 마지막으로 밀도 구배 층을 최대한 제거합니다.
6. 호중구/적혈구 혼합물에서 호중구를 분리하려면 적혈구를 차갑고 멸균된 증류수로 용해합니다.
   1. 냉장고에서 차갑고 멸균된 증류수 병과 10배 농축 PBS 플라스크를 꺼냅니다.
   2. 이 단계를 위해 신속하게 작업합니다. 펠릿 위에 직접 차갑고 멸균된 증류수 36mL를 넣고 조심스럽게 한 번 섞습니다. 20초 후에 10x PBS 4mL를 첨가하여 등장성 용액을 만듭니다. 한 번 조심스럽게 섞습니다.
   3. 739 x g 및 4 ° C에서 5 분 동안 튜브를 스핀합니다 (적혈구 제거 용). 호중구는 흰색 펠릿에 있습니다.
   4. 상층액을 조심스럽게 버리십시오. 1.6.2단계를 다시 수행하고 펠릿이 제대로 매달려 있는지 확인합니다.
   5. 328 x g 및 4 °C에서 5분 동안 튜브를 회전시킵니다.
   6. 상등액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 PBS 5mL에 재현탁합니다. 호중구를 세고 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 혈액 튜브 1개(10mL)의 예상 수율은 약 1,500만-7,500만 개입니다.

2. 호중구의 적색 형광 세포 표지

1. 15mL 튜브에 2mL의 PBS에 1,0-2,000만 개의 호중구를 현탁액으로 만듭니다.
2. 다른 15 mL 튜브에서 4 μL의 2 μM 적색 형광 세포 링커(재료 표 참조)가 있는 2 mL PBS 용액을 만듭니다. 이것을 호중구 현탁액에 부드럽게 넣고 조심스럽게 섞습니다.
3. 37°C에서 정확히 25분 동안 어둠 속에서 배양하여 적색 형광 세포 링커로 호중구를 표지합니다.
4. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지를 RT에서 최대 15mL까지 첨가하여 라벨링을 비활성화하고 조심스럽게 한 번 혼합합니다. 펠릿이 형성된 경우 펠릿이 조심스럽게 재현탁되었는지 확인하십시오.
5. 328 x g에서 5분 동안 튜브를 돌리고 RT합니다.
6. 상층액을 제거하고 RT에서 2% FBS 및 10% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 함유한 5mL의 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배지에 펠릿을 재현탁합니다.호중구를 세십시오.
   메모: 적색 형광 세포 표지 후 50%의 세포 손실이 발생할 수 있습니다.

3. 호중구 세포외 트랩 형성 유도

1. 2% FBS 및 10% P/S를 포함하는 페놀 레드가 없는 RPMI 1640 배지에서 0.42 x 10⁶ cells/mL의 세포 현탁액을 만듭니다.
2. 검은색 96웰의 평평한 바닥 플레이트에 웰당 90μL에 37,500개의 호중구를 추가합니다.
3. 선택한 자극(예: 환자의 혈청) 10μL를 3회씩 첨가하여 웰에서 10%의 농도에 도달합니다. 항상 삼중으로 음수 대조군(중간)을 포함하십시오.
4. 37°C의 어두운 곳에서 30분에서 2, 4 또는 6시간 사이의 원하는 시간 동안 배양합니다. 4시간 동안 배양하는 것이 좋습니다.
5. 웰에서 1μM의 최종 농도에 도달하기 위해 25μL의 5μM 불투과성 DNA 염료(재료 표 참조)를 추가하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 필요한 경우 2% FBS 및 10% P/S를 함유하는 RPMI 1640 배지에 사전 희석하여 5μM 농도를 얻습니다.
6. 배양 시간이 끝나기 15분 전에 5μM 불투과성 DNA 염료 25μL를 추가합니다. 어둠 속에서 37 °C에서 15 분 더 배양을 계속합니다.
7. 상등액(~125μL)을 매우 조심스럽게 제거하고 필요한 경우 보관하십시오. 100μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 어두운 곳에 보관하고 즉시 4단계를 계속하십시오.

4. 3D High-content, High-resolution Immunofluorescence Confocal Microscopy를 사용한 호중구 세포 외 트랩(NET) 시각화

1. Acquisition 설정을 클릭하여 immunofluorescence 컨포칼 현미경의 설정을 구성합니다.
   1. 구성 탭을 클릭합니다.
   2. 목표물과 카메라를 선택합니다. 컨포칼 60μm 핀홀의 획득 모드가 있는 10X Apo Lambda 대물렌즈를 선택합니다.
   3. 플레이트를 클릭하고 96웰 플라스틱 플레이트를 선택합니다. 방문할 사이트를 선택하고 고정된 수의 사이트를 선택합니다. 겹치지 않는 3개의 열과 3개의 행(0μm)을 채우면 총 웰의 45%를 덮습니다.
   4. Acquisition을 클릭합니다. 레이저 기반 초점 사용을 선택합니다. 필요한 경우 Z Series/Time Series Acquire 를 선택합니다.
   5. 사이트 자동 초점을 클릭합니다.
      1. Focus on Plate Bottom | Bottom Thickness에 의한 오프셋을 클릭합니다. 초기 웰에서 샘플을 찾으려면 첫 번째로 획득한 웰을 선택합니다. 사이트 자동 초점의 경우 모든 사이트를 선택합니다.
   6. Wavelengths(파장)를 클릭합니다.
      1. 파장 수로 2를 선택합니다. TL 음영 보정 미세 조정 수준으로 2를 선택합니다.
      2. Wavelength 1(파장 1)에서 Texas Red(텍사스 레드)를 선택합니다.
         1. 자동 초점 옵션의 경우 Z 오프셋이 있는 레이저, 레이저 오프셋 1.1μm를 선택합니다. 사용자 정의 범위가 200-10인 Z 스택을 사용합니다.
      3. Wavelength 2(파장 2)에서 fluorescein isothiocyanate(FITC)를 선택합니다.
         1. 자동 초점 옵션의 경우 w1 0μm에서 Z 오프셋이 있는 레이저를 선택합니다. 사용자 정의 범위가 200-10인 Z 스택을 사용합니다.
         2. 획득 옵션의 경우 Z 시리즈 및 2D 프로젝션 이미지 최대값을 선택합니다. 획득 옵션으로 음영 보정(Shading Correction) | 꺼짐.
   7. Z 시리즈를 선택합니다. 단계 수를 선택합니다: 10. 단계 크기를 선택합니다: 3μm(총 범위는 27μm).
2. 플레이트를 면역형광 컨포칼 현미경 검사에 넣습니다.
   1. 실행 탭을 클릭합니다.
      1. 플레이트 이름과 설명을 입력하고 보관 위치를 선택합니다.
      2. 획득해야 하는 우물을 선택합니다.
3. Texas Red 및 FITC에 대한 노출 시간을 선택합니다.
4. Acquire Plate를 클릭하여 수집을 시작하며, 플레이트당 약 1시간이 소요됩니다.

5. NET 형성 분석

1. 과학적 다차원 이미지 분석을 위해 설계된 이미지 처리 프로그램(Table of Materials(재료 표 참조)을 사용하여 NET 형성을 분석합니다.
2. 획득한 이미지 데이터를 별도의 하드 드라이브로 전송합니다.
3. 색상 추가 도구를 선택합니다.
   1. w1을 선택하고 데이터가 저장된 하드 드라이브의 폴더를 선택합니다.
   2. w2를 선택하고 데이터가 저장된 하드 드라이브의 폴더를 선택합니다.
      메모: 파일 이름에 w1을 사용하여 Texas Red 이미지에 빨간색을 추가하고 w2를 사용하여 FITC 이미지에 녹색을 추가하는 표준 매크로를 사용합니다.
4. 분석 매크로를 선택합니다.
   1. w1을 선택하고 임계값(intensity threshold)을 선택하며, 이는 일반적으로 10입니다. 원하는 픽셀 값(크기 임계값, 예: 100)을 선택합니다.
   2. w2를 선택하고 임계값(intensity threshold)을 선택하며, 이는 일반적으로 10입니다. 원하는 픽셀 값(크기 임계값, 예: 500)을 선택합니다.
   3. 스프레드시트 파일의 대상을 선택하고, 분석을 실행하고, 나중에 로그 파일을 저장합니다.
5. 스프레드시트에서 데이터를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아쿠아 멸균 H2O	B. Braun, Melsungen, 독일	12604052
소 태아 혈청(FBS)	Bodinco, Alkmaar, 네덜란드		고농도에서 사용해, 그것은 influcence 그물 대형을 할 수 있었습니다
Ficoll 5,7 % - amidotrizoaat 9 % 밀도 1,077 g / mL	LUMC, 라이덴, 네덜란드	97902861
면역형광 컨포칼 현미경	이미지: Xpress Micro Confocal(Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일)
중화 PBS(10배)	Gibco, 페이즐리, 영국	제70011-036
페니실린 / 스트렙토마이신 (p/s)	Gibco, 페이즐리, 영국	15070063
페놀 무레드 RPMI 1640 (1x)	Gibco, 페이즐리, 영국	11835-063	페놀 레드는 면역 형광 신호를 방해할 수 있습니다.
인산염 완충 식염수(PBS)	B. Braun, Melsungen, 독일	174628062
PKH26 2 uM 적색 형광 세포 링커	Sigma Aldrich Saint-Louis, 미주리, 미국	PKH26GL-1KT	PKH는 특허받은 형광 염료이며 발견자 Paul Karl Horan의 이름을 딴 세포 라벨링 기술입니다
과학적 다차원 이미지 분석을 위한 프로그램	ImageJ, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) 연구 서비스 분과
RPMI 매체 1640 (1x)	Gibco, 페이즐리, 영국	52400-025
Sytox green 5 mM 불침투성 DNA 염료	Gibco, 페이즐리, 영국	57020
트리판 블루 스테인 0,4%	Sigma Aldrich, 독일	17942E
96-well, 검정색, 바닥이 편평한 조직 배양 처리된 플레이트	팔콘, 뉴욕, 미국	353219