방법 논문

대식세포에서 Cryptococcus neoformans 감염을 검출하기 위한 젖산 탈수소효소 방출 분석

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Ball, B., et al. 발견 기반 숙주-병원체 상호작용을 위한 무표지 정량적 단백질체학 워크플로우. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오에서는 대식세포의 병원성 곰팡이인 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans) 감염을 평가하기 위한 세포독성 분석을 시연합니다. 세포 독성은 Cryptococcus neoformans 감염으로 인한 대식 세포 용해로 인한 세포질 젖산 탈수소 효소의 방출에 의해 결정됩니다.

프로토콜

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1. 감염 확인

참고: 세포독성 분석을 사용하여 감염 숙련도를 측정할 수 있습니다. 다음 프로토콜은 LDH(젖산 탈수소효소) 방출을 측정하기 위한 세포 독성 산물의 적용을 강조합니다. 다른 세포 독성 제품도 사용할 수 있습니다.

  1. 대식 세포 세포의 C. neoformans 감염의 준비
    1. 곰팡이 세포의 준비
      1. 글리세롤 스톡을 사용하여 효모 추출물 펩톤 덱스트로오스(YPD) 한천 플레이트에 야생형 C. neoformans 균주(H99)를 줄무늬 배열하여 단일 콜로니를 분리합니다.
      2. 정적 인큐베이터에서 37 ° C에서 16 시간 동안 밤새 배양하십시오.
      3. 느슨하게 뚜껑을 닫은 10mL 시험관에 5mL의 YPD 육액을 넣고 야생형 C. neoformans 균주 및 배양의 단일 콜로니를 선택합니다. 4배로 수행합니다.
      4. 37°C에서 200rpm의 진탕 인큐베이터에서 16시간 동안 밤새 배양합니다.
      5. 다음 날, 1:100 희석하여 3mL YPD 육수에 각각 하룻밤 배양합니다.
      6. 곰팡이 배양의 광학 밀도(OD600nm) 값을 측정하여 mid-log 단계를 결정합니다. 분광 광도계에 따라 C. neoformans 야생형 균주는 일반적으로 1.0에서 1.5 범위의 일반적인 OD600nm 값으로 YPD에서 6-8시간 배양 후 중간 로그 단계에 도달합니다.
      7. 세포가 mid-log 단계에 도달하면 10μL의 진균 세포 현탁액을 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 멸균 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에서 1:100으로 희석합니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
      8. 1,500 x g에서 10분 동안 세포를 수집 및 원심분리한 후, 멸균된 실온 PBS로 펠릿을 부드럽게 세척한 후 총 3회 세척을 반복합니다.
      9. 무항생제 세포 배양 배지에서 세포를 재현탁시켜 1.2 x 108 cells/mL의 농도를 달성합니다.
    2. 대식세포 세포의 준비
      1. 6웰 플레이트의 각 웰을 시각화하여 세포가 70-80% 합류점에 도달했는지 확인합니다. 또는 세포를 측정하여 웰당 약 1.2 x 106개의 대식세포 세포를 달성할 수 있습니다.
      2. 세포 배양 작업 전에 항생제가 보충된 배지를 37°C로 가열합니다. 세포 배양 작업 전에 작업 환경이 멸균되었는지 확인하십시오. 광학 현미경을 사용하여 세포를 시각화하여 세포가 부착되고 건강한지 확인합니다.
      3. 혈청학적 피펫 또는 진공 흡인기로 접시에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
      4. 5-7mL의 멸균 실온 PBS(인산염 완충 식염수)를 60 x 15mm 접시에 부드럽게 추가합니다.
      5. 접시를 부드럽게 기울여 부착된 세포를 씻습니다.
    3. C. neoformans와 대식세포 세포의 공동 배양
      1. 재현탁된 C. neoformans 세포 1mL를 대식세포 세포가 포함된 4개의 웰에 추가합니다.
        메모: 실험을 시작하기 전에 필요한 플레이트의 수를 계산해야 합니다. 빈 웰에 항생제가 없는 배지 1mL를 추가합니다.
      2. 세포가 37 ° C에서 5 % CO2로 3 시간 동안 배양하도록합니다.
      3. 혈청학적 피펫 또는 진공 흡인기를 사용하여 플레이트에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
      4. 멸균 실온 PBS 1mL를 부드럽게 첨가합니다.
      5. 플레이트를 부드럽게 기울여 부착되지 않았거나 식세포작용되지 않은 세포외 C. neoformans 세포를 세척합니다.
      6. 1mL의 무항생제 배지를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
      7. 37 ° C에서 5 % CO2로 세포를 배양합니다.
    4. 선택한 시점(예: 1, 3, 6, 12, 24시간)에서 제조업체의 지침에 따라 LDH 방출을 측정하기 위해 상층액을 수집합니다.
    5. 동시에 감염되지 않은 대식세포 세포는 최대 세포 독성을 위해 결정된 값으로 용해됩니다.
    6. 세포 독성을 다음과 같이 계산합니다.
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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100mM 트리스-HCl, pH 8.5피셔 사이언티픽BP152-14°C에서 유지
60 x 15mm 접시, Nunclon 델타써모피셔 사이언티픽174888
6웰 세포 배양 플레이트써모피셔 사이언티픽140675
원뿔형 매 튜브(15mL)피셔 사이언티픽05-539-12
Countess II 자동 세포 계수기써모피셔 사이언티픽AMQAX1000필수는 아니며 혈구계를 대안으로 사용할 수 있습니다.
CytoTox 96 비방사성 세포독성 분석프로메가G1780 (영문
DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제써모피셔 사이언티픽10566016
소 태아 세럼(FBS)써모피셔 사이언티픽1248302060°C에서 30분 동안 배양하여 불활성화시킵니다. 50ml의 부분 표본과 급속 냉동을 준비합니다. 미디어 준비 전 해동
혈구계폭스바겐제15170-208
헤페스시그마 알드리치H3375 (영문40 mM HEPES/8 M Urea를 벌크 원액에 준비하고 급속 냉동하여 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오. 사용 후에는 폐기하십시오(반복적으로 동결-해동하지 마십시오).
L-글루타민써모피셔 사이언티픽25030081저장을 위해 분취 및 냉동 할 수 있습니다. 미디어 준비 전에 해동하십시오.
마이크로 원심분리기에펜도르프13864457
페니실린 : 스트렙토마이신 10k/10k폭스바겐CA12001-692저장을 위해 분취 및 냉동 할 수 있습니다. 미디어 준비 전에 해동하십시오.
인산염 완충 식염수폭스바겐CA12001-676구매가 필요하지 않습니다. PBS도 준비할 수 있지만 사용하기 전에 멸균 여과를 수행해야 합니다.
피펫, 일회용 혈청학적(10mL)피셔 사이언티픽13-678-11E
피펫, 일회용 혈청학적(25mL) Basix피셔 사이언티픽14955235
트립신/Lys-C 프로테아제 혼합물, MS 등급뚫다A40007-20 °C에서 유지하십시오.
요소시그마 알드리치U1250-1KG40 mM HEPES/8 M 요소를 벌크 원액에 준비하고, 급속 냉동하고, 사용할 때까지 -20 °C에서 보관합니다. 사용 후에는 폐기하십시오(반복적으로 동결-해동하지 마십시오).
효모 추출물 펩톤 포도당 육수BD 디프코비엠20
(영문) ) 호 ) 년

재인쇄 및 허가

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태그

LDH

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