투과성 멤브레인 시스템에서 배양된 감염된 숙주 세포에서 숙주 세포 용해물 추출

초록

출처: Flaherty, R. A., et al. 포유류 숙주 세포에 대한 분비 박테리아 독소의 영향을 연구하기 위한 투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 박테리아 독소가 숙주 세포에 미치는 영향을 통제되고 격리된 방식으로 조사하기 위한 투과성 멤브레인 삽입 시스템을 보여줍니다. 이 접근 방식을 사용하면 세포를 독소에 선택적으로 노출시키는 동시에 자연적인 숙주-병원체 상호 작용을 모방하는 물리적 분리를 유지할 수 있습니다.

프로토콜

1. 박테리아 배양

1. 관심 있는 특정 분비 인자의 연구에 사용할 동종 돌연변이 균주를 생성합니다.
   메모: 이러한 실험에 사용된 GASM1T1 5448 연쇄상구균 균주에는 WT GAS', sagAΔcat SLS-결핍 돌연변이체(본문에서 ΔsagA로 축약됨) 및 sagA 보완 균주(본문에서 ΔsagA+sagA로 축약됨)가 포함되었습니다.
2. 관심 박테리아 균주의 하룻밤 액체 배양을 준비합니다.인간 세포를 감염시키기 전에 16-20시간 동안 37°C에서 -10ml의 Todd-Hewitt 육수에 GAS M1T1 5448 균주를 배양합니다.
3. 하룻밤 동안 박테리아 배양액을 원심분리기(10분 동안 2,400rcf)하고 신선한 박테리아 배지에 재현탁합니다.
   메모: 하룻밤 배양물을 성장시킨 것과 동일한 부피(5-10 ml)의 재현탁은 일반적으로 바람직한 초기 광학 밀도를 생성한다.
4. 테스트할 모든 균주에 대해 600nm(OD600)에서 동일한 광학 밀도를 얻을 때까지 재부유 배양물을 추가 박테리아 배지에서 희석하여 박테리아 배양을 동일한 시작 농도로 정규화합니다(편의상 약 1.0의 OD600 권장).
   메모: 이 연구에서는 정상화 직후 숙주 세포를 감염시키기 위해 고정상(stationary phase) 박테리아 배양을 사용했습니다. 그러나 일부 박테리아 균주는 고정상을 비동기식으로 종료하기 때문에 관심 균주에 대한 경우인 경우 로그 위상 배양으로 숙주 감염을 시작하는 것이 더 적절할 수 있습니다.
5. 추가 분석에 앞서, 콜로니 카운팅 분석을 수행하여 시작 배양에 존재하는 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU)를 측정하여 감염의 다양성(MOI) 또는 숙주 세포당 박테리아의 비율을 측정할 수 있습니다.
   1. 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 적절한 박테리아 성장 배지(이 연구에서는 Todd-Hewitt 육액이 사용됨)에서 원하는 광학 밀도로 정규화된 박테리아 배양물의 연속 희석액 1ml를 준비합니다. ^10-1에서 10-6 범위의 희석액을 준비하여 가산 콜로니(30-300 콜로니)가 있는 적어도 한 세트의 한천 플레이트를 생성합니다. 모든 희석을 세 번 수행합니다.
   2. 각 연속 희석액 100μl를 분석 중인 박테리아 종에 적합한 배지가 들어 있는 한천 플레이트로 옮깁니다.
      메모: 이 연구에는 Todd-Hewitt 한천이 사용되었습니다.
   3. 유리 또는 플라스틱 박테리아 스프레더를 사용하여 100μl 분취액을 한천 플레이트의 전체 표면에 고르게 분포시키고 액체가 한천에 흡수될 때까지 계속 퍼뜨립니다. 멸균 기술을 사용하여 화염 아래에서 수행합니다.
   4. 하룻밤 동안 또는 셀 수 있는 군체가 나타날 때까지 37°C에서 한천 플레이트를 배양합니다.
   5. 각 플레이트에서 자라는 콜로니를 세고 다음 공식으로 원래 배양의 CFU/ml를 계산합니다: 콜로니 수 x 연속 희석/배양 부피의 역수(밀리리터).
      예: (200 콜로니 x 1/^10-5 희석) / 0.1 ml 도금 = 2.0 x 10⁸ CFU/ml

2. 숙주 세포 배양

1. 원하는 분석에 적합한 숙주 세포주를 얻습니다.
   메모: V. Nizet의 친절한 선물인 HaCaT 인간 상피 각질 세포29가 이러한 연구에 사용되었습니다.
   1. 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)의 100mm 배양 접시에서 HaCaT 세포를 유지합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 배양하십시오.

3. 투과성 멤브레인 삽입 시스템을 통한 숙주 세포 감염

1. 적절한 조직 배양 접시에 세포를 플레이트화하고 90% confluency에 도달할 때까지 성장하도록 합니다.
   참고: 이러한 연구에 사용된 HaCaT 세포는 일반적으로 도금 후 2-3일 이내에 융합에 도달합니다.
   1. 용해물 채취(예: 신호 분석 및 아데노신 삼인산(ATP) 측정 분석)의 경우, 약 3 x 10⁵ cells/well의 파스딩 밀도로 6개의 웰 디쉬에 HaCaT 세포를 플레이트
   링합니다.
   2. 면역형광 이미징 실험의 경우, 멸균 유리 커버의 플레이트 세포는 약 3 x 10⁵ cells/well의 파종 밀도로 6웰 접시 내에서 미끄러집니다.
   3. 에티듐 호모다이머 멤브레인 투과화 및 젖산 탈수소효소(LDH) 방출 분석의 경우, 약 5 x 10⁴ cells/well의 파스딩 밀도로 24웰 접시에 HaCaT 세포를 플레이트
   화합니다.
2. 치료 직전에 1x 멸균 PBS로 세포를 세척합니다.
3. 세포에 신선한 성장 배지를 바르십시오. 여기에 설명된 조건의 경우, 6웰 플레이트의 경우 웰당 2ml 배지를 적용하거나 24웰 플레이트의 경우 웰당 0.5ml 배지를 적용합니다. 약물 치료를 테스트하는 경우 새 배지와 혼합하여 이 단계에서 적용하십시오.
   메모: 일부 분석에는 대체 배지가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 페놀 레드 및 높은 혈청 농도가 LDH 방출 분석을 방해하기 때문에 1% 소 혈청 알부민(BSA)(w/v), 2mM L-글루타민 및 1mM 피루브산 나트륨이 보충된 페놀 레드가 없는 DMEM을 이러한 실험에 활용했습니다.
4. 새 배지를 적용한 후 각 웰에 멸균 0.4μm 투과성 멤브레인 인서트를 조심스럽게 놓습니다. 층류 후드에서 이 단계를 수행하고 멸균 집게를 사용하여 투과성 멤브레인 인서트를 각 웰로 옮깁니다.
5. 제조업체의 지침에 따라 각 웰의 상부 챔버에 신선한 세포 배양 배지를 적용합니다. 여기에 설명된 조건의 경우, 6웰 플레이트의 경우 웰당 1ml 배지를 적용하거나 24웰 플레이트의 경우 웰당 0.1ml 배지를 적용합니다.
6. 적절한 부피의 정규화된 박테리아 배양물(섹션 1 참조)을 투과성 멤브레인 삽입 시스템의 상부 챔버에 적용합니다. 감염되지 않은 대조군 치료를 위해 박테리아 배지를 사용하십시오. 여기에 설명된 결과를 위해 24웰 플레이트에 대해 챔버당 정규화된 배양액 25μl를 추가하고 6웰 플레이트에 대해 챔버당 배양액 100μl를 추가합니다.
   참고: 이 연구에서는 야생형 또는 돌연변이 GAS를 MOI 10으로 숙주 세포에 적용했습니다. MOI는 최종 진핵 세포 수(예: 2 x 10⁶ cells/well)를 기반으로 계산되었으며, 감염 기간이 시작될 때 숙주 세포당 10배 많은 박테리아가 추가되었습니다(예: 웰당 2 x 10⁷ CFU). 적절한 MOI는 박테리아 종과 원하는 후속 분석에 따라 달라집니다.
   참고: 감염되지 않은 대조군에 박테리아 배지를 사용하는 것 외에도 이 기술의 특정 응용 분야에 대한 다른 유용한 제어에는 비교를 위해 열에 의해 죽은 박테리아 또는 사용된 박테리아 배지가 포함될 수 있습니다.
7. 감염된 세포를 37°C에서 5% CO₂로 배양합니다.

4. 샘플 수집

1. 후속 분석을 위해 세포 배양 배지, 숙주 세포 용해물 또는 온전한 세포가 있는 유리 커버슬립을 수집하려면 먼저 멸균 겸자로 투과성 멤브레인 삽입물을 조심스럽게 제거합니다.
2. 숙주 세포 용해물 평가:
   1. 숙주 세포의 단층 위의 배지를 부드럽게 흡인합니다. 단층을 방해하면 샘플 손실이 발생할 수 있으므로 피하십시오.
   2. 1x PBS로 세포를 한 번 헹굽니다.
   3. PBS를 부드럽게 흡입합니다. 원하는 단백질 농도를 얻기 위해 즉시 적절한 양의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 적용하고 15분 동안 얼음 위에서 샘플을 배양합니다. 각 6-웰 플레이트의 웰당 200 μl에서 350 μl의 용해 완충액을 적용하여 0.5 및 1.5 mg/ml.
      사이의 단백질 농도를 달성합니다. 참고: 이 연구에 사용된 용해 완충액은 탈이온수, 1%(v/v) Nonidet P40 대체물, 인산가수분해효소 억제제 칵테일 및 프로테아제 억제제 칵테일로 구성되었습니다. 특정 시약은 재료 및 장비 섹션에 나열되어 있습니다.
   4. 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 웰의 플레이트 표면에서 셀을 분리하고 각 웰의 전체 내용물을 1.5ml 튜브에 피펫으로 넣습니다.
   5. 14,000 rcf에서 4°C에서 20분 동안 원심분리기 샘플.
   6. 용해성 용해물 성분을 평가하려면 상층액을 새 튜브로 제거하고 -20°C에서 보관하거나 즉시 사용하십시오.
   7. 핵 또는 기타 불용성 용해물 성분을 평가하려면 펠릿을 예약하고 -20°C에서 보관하거나 즉시 사용하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HaCaT 인간 상피 각질 세포			Victor Nizet의 실험실에서 선물.
둘베코의 변형 독수리 배지(DMEM)	생명 기술	11995-073	관심 세포주에 적합한 배지를 사용합니다.
소 태아 세럼(FBS)	바이오웨스트	S162H	관심 세포주에 적합한 배지 첨가제를 사용합니다.
10cm 조직 배양 접시	눕크	150350	다른 브랜드가 적합합니다.
6웰 조직 배양 접시	사이토원	CC7682-7506	다른 브랜드도 적합하지만 코닝 인서트와 호환되어야 합니다.
콜라겐 코팅된 0.4μm Transwell 인서트(6웰)	코 닝	3540
콜라겐 코팅된 0.4μm Transwell 인서트(24웰)	코 닝	3595
셀 스크레이퍼	피셔브랜드	08-100-241	이는 세포 용해물을 수집하는 데만 필요합니다.
Nonidet P40 대체품	시그마	74385-1L	다른 공급업체가 적합합니다.

년 년 년 년