박테리아에 감염된 세포의 칼슘 반응을 연구하기 위한 이미징 기술

초록

출처: Smail, Y., et al. 상피 세포의 시겔라 감염 중 이미징 ca²⁺ 반응. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 인간 상피 세포의 Shigella 감염 시 지역 및 전역 칼슘 이온 반응을 감지하는 기술을 보여줍니다. Shigella는 숙주 세포에 침입하여 침입 효과기를 방출하여 세포 내 칼슘 수치에 영향을 미칩니다. 국소 및 전체 세포질 칼슘의 진폭과 빈도는 형광 지표를 사용하여 연구됩니다.

프로토콜

1. 준비

사항

1. 박테리아 제제
   1. 0.01% 콩고 레드(CR)가 함유된 트립티카제 소이(TCS) 한천 플레이트에 AfaE 접착체(M90T-AfaE)를 발현하는 Shigella 야생형 균주인 박테리아를 플레이트화하고 37°C에서 18시간 동안 배양합니다.
      메모: 재현성을 높이기 위해 1.1.1 단계에서 얻은 Shigella 플레이트는 4 °C에서 보관되며 CR 배지의 모든 콜로니는 결국 시간이 지남에 따라 빨간색으로 변하기 때문에 일주일 이내에 사용해야 합니다.
   2. 줄무늬 플레이트에서 3개의 빨간색 군체를 선택하여 TCS 육수 배양 전 접종합니다.
      메모: 독성 플라스미드가 유전자 재조합을 거친 단일 클론을 선택할 확률을 제한하기 위해 3개의 콜로니에 대한 접종이 수행됩니다.
   3. 진탕 인큐베이터에서 37°C, 200rpm으로 16시간 동안 액체 박테리아 배양을 성장시킵니다. 75mg/mL의 최종 농도에서 암피실린을 첨가합니다. 항생제의 과잉은 큰 독성 플라스미드의 손실로 이어질 수 있으므로 항생제 농도는 최소 억제 농도의 3배를 초과해서는 안 됩니다.
      메모: Shigella 독성 플라스미드의 유지는 적절한 항생제 농도가 보충된 CR 플레이트에 박테리아 배양액을 도금하여 검증해야 합니다. 백색 군체의 존재는 플라스미드 손실을 나타냅니다.
   4. TCS 배양액에 박테리아 전배양을 1:100 희석하여 접종합니다. 37 °C의 진탕 인큐베이터에서 200rpm으로 2시간 동안 배양합니다. 600nm(OD_600nm)에서 광학 밀도가 0.2 - 0.4인지 확인합니다.
   5. 21°C에서 13,000 x g에서 2분 동안 박테리아 배양을 원심분리하고 펠릿을 등가의 EM 배지(120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM 포도당 및 25 mM HEPES, pH = 7.3)에 재현탁합니다.
   6. EM buffer에 세균 현탁액을_{0.1의 최종 OD 600nm}에서 희석하여 즉시 사용하거나 21°C에서 보관한 후 60분 이내에 사용합니다.
2. 세포 준비
   1. 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 포도당 1g/L로 DMEM에서 HeLa 세포를 배양하고 10%_CO2로 37°C에서 성장시킵니다. 10% CO₂를 함유하는 37°C 인큐베이터에서 10% FCS 및 비필수 아미노산을 함유한 4.5g/L의 포도당으로 DMEM에서 성장한 TC-7을 성장시킵니다.
   2. 세포 유지를 위해 세포를 정기적으로 분할하여 융합 상태와 연결된 성장-접촉 억제를 피해야 합니다. 이는 높은 Ca²⁺ 프로브 로딩/transfection 효율에 매우 중요합니다.
   3. HeLa 세포를 HeLa 세포에 대한 실험 전날 3 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 있는 멸균 25mm 직경의 원형 커버슬립에
   플레이트합니다.
   4. TC-7 세포의 경우, 세포를 트립신화하고 계수합니다. 4 x 10⁵ cells/well에 파종하고 실험 전에 10% CO₂ 인큐베이터에서 37 °C에서 5 - 7일 동안 배양하여 분극을 허용합니다.
      1. 실험 당일까지 매일 세포 배양 배지를 새로 고칩니다.
         메모: 유리 바닥 35mm 직경의 일회용 챔버는 커버 슬립 함유 우물의 대안으로 사용될 수도 있습니다. 후자를 사용하는 경우 가열된 스테이지 또는 대물렌즈를 통한 온도 제어가 충분하지 않으며 현미경 스테이지에 장착된 온도 조절기 배양 챔버가 필요합니다.
3. 실험 당일, 배지를 제거하고 21°C에서 1mL EM 배지로 셀을 3x 세척합니다.
4. EM 버퍼에 3mM Fluo-4/acetoxymethyl ester(Fluo-4-AM)를 21°C에서 30분 동안 로드합니다
   메모: sub-confluent HeLa cell의 loading은 큰 문제를 일으키지 않지만, polarized TC-7 cell의 loading은 종종 이질적이고 효율성이 떨어집니다. 이러한 세포의 경우, Fluo-4-AM 함유 EM에 최종 농도 0.1%의 분산제(pluronic acid)와 최종 농도 20μM의 음이온 수송체 억제제 bromosulfophtalein을 첨가하여 로딩 효율이 향상되는 것을 발견했습니다. 이중 획득이 필요한 비율계량 화학 프로브 또는 유전적으로 인코딩된 FRET 프로브의 사용은 국소 Ca²⁺ 반응의 이미징에 필요한 획득 속도와 호환되지 않습니다.
5. EM 버퍼로 샘플을 3x 세척하고 21°C에서 1mL의 EM 버퍼에서 추가로 배양하여 AM 부분의 가수분해를 허용합니다. Fluo-4가 로드된 셀을 즉시 또는 다음 90분 이내에 사용하십시오(21°C 유지).

2. 국소 ca²⁺ 반응의 감염 및 이미지 획득

1. Fluo-4가 로드된 세포가 들어 있는 커버슬립을 이미징 챔버 또는 유리 바닥 챔버에 놓습니다. 이미징 챔버 또는 유리 바닥의 일회용 챔버에서 EM 버퍼로 샘플을 3x 세척하여 세포 용해로 인해 발생할 수 있는 화합물을 제거합니다. EM 완충액 1mL를 추가합니다.
2. 33°C로 가열된 도립 형광 현미경 스테이지에 챔버를 놓습니다.
   메모: 이 온도는 Shigella 침입 과정과 호환되는 최적의 온도와 국소 반응을 시각화하기 위해 Ca²⁺ 반응의 둔화 사이의 절충안으로 선택됩니다. 위상차 링이 장착된 63X 이멀젼 오일 대물렌즈(NA = 1.25)를 사용합니다.
3. 현미경 필드를 선택하고 필요한 경우 노출 시간 및 비닝을 포함한 획득 매개변수를 설정하여 Fluo-4 형광 신호를 최적화합니다.
   메모: 로컬 Ca²⁺ 이미징의 주요 과제는 진폭이 작고 응답 지속 시간이 짧아 최소 30ms마다 수집이 필요하다는 것입니다. 여러 상용 이면조사형 전자 증식 전하 결합 소자(EM-CCD) 또는 상보형 금속 산화물 반도체(C-MOS) 카메라는 Fluo-4를 사용하여 국소 Ca²⁺ 반응을 감지하는 데 필요한 감도를 제공합니다. 검출 민감도는 또한 고주파에서 Fluo-4의 형광 여기와 관련된 자발적 반응과 같은 광손상 또는 인공물을 제한하는 데 중요한 문제입니다. 여기서, 470nm의 LED 기반 조명, 480 ± 40nm 대역 통과 여기 필터, 505nm 이색성 필터 및 1.0 중립 밀도 필터와 결합된 최대 강도의 5%에서 사용되는 527 ± 30nm 대역 통과 방출을 사용하여 제한된 기간의 획득 스트림에서 이러한 문제를 최소화했습니다. 120s 스트림의 배치에 의한 로컬 Ca²+ 신호의 분석이 일상적으로 수행되었습니다. 이러한 낮은 조명 조건에서는 2분 스트림 획득 중에 형광단 광표백이 관찰되지 않았습니다. 동일한 샘플에 대한 연속적인 수집은 다른 필드가 사용되는 경우 수행할 수 있습니다. 일반적으로 첫 번째 획득 스트림은 자발적인 반응이 없음을 보장하기 위해 박테리아 자극이 없는 제어 필드에서 수행됩니다. 자발적 반응이 관찰되는 경우, 반응이 관찰되지 않을 때까지 샘플을 EM 버퍼로 세척합니다.
4. 샘플에 박테리아를 추가하려면 챔버에서 500μL의 EM 버퍼를 제거하고 1.1.6단계에서 준비한 500μL의 박테리아 현탁액을 추가하여 선택한 현미경 필드가 이동하지 않도록 적절한 주의를 기울여 0.05의 최종 OD_600nm를 얻습니다. 부피는 박테리아의 적절한 혼합과 세포 샘플에 대한 박테리아의 균일한 분포를 보장합니다.
5. 박테리아 추가에 대한 획득을 수행합니다. 또는 박테리아 추가 후 10분 후에 수집을 수행하는데, 이는 사용된 조건에서 박테리아가 세포에 침전되는 데 필요한 시간에 해당합니다. 획득 스트림이 끝나면 선택한 필드의 위상차 이미지를 획득하여 세포와 접촉하는 박테리아 및 박테리아 침입 부위와 관련된 멤브레인 주름을 시각화합니다.
6. 이미지 획득, 파일 저장 및 전체 프로세스를 포괄하는 새 필드 선택 기간에 따라 가능한 간격으로 2.5단계에서와 같이 획득 절차를 반복합니다.
   참고: Shigella의 경우, 10분 동안의 박테리아 침전 후 20분 동안 5분마다 획득 스트림이 발생하여 대부분의 침입 이벤트를 커버할 수 있음을 발견했습니다.
7. 획득 절차가 끝나면 Ca²⁺ ionophore ionomycin 샘플의 최종 농도 2μM를 추가하여 Ca²⁺ 신호의 최대 진폭을 결정합니다. 신호가 안정화될 때까지 3 - 5초마다 이미지를 획득하며, 일반적으로 10분 미만 동안 촬영합니다.
8. 그런 다음 Ca 2+가 없을 때 형광 신호를 결정하기 위해 10mM의 최종 농도에서 Ca²⁺ 킬레이터 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N, N, N, N'-테트라아세트산(EGTA)을 추가합니다. 신호 안정화까지 3 - 5초마다 이미지를 획득하며, 일반적으로 10분 미만 동안 촬영합니다.
   메모: 글로벌 Ca²⁺ 변이의 역학이 상대적으로 느리기 때문에 3 - 5초마다(스트리밍 모드가 아님) 이러한 획득을 수행하여 연속 처리 중에 동일한 현미경 필드에서 Ca²⁺ 이미징을 허용합니다.

3. 분석

1. 시간 경과에 따른 세포질 Ca²⁺ 변화를 ΔF/F0의 백분율로 표현하며, 여기서 ΔF는 관심 영역(ROI)의 평균 형광 강도의 변화를 나타내고 F0는 동일한 ROI에서 기준선 형광을 나타내며, 여기서 세포가 없는 필드의 관련 없는 영역을 뺍니다.
   1. 기준선 수준에 해당하는 다른 필드의 각 세포에 대한 기초 형광 수준을 제거합니다. 이러한 수준은 주어진 스트림 획득에서 국소 Ca²⁺ 반응의 빈도가 낮고 상대적으로 짧은 지속 시간으로 인해 명확하게 결정될 수 있습니다.
      참고: 질문과 연구된 병원성 모델과 관련된 응답의 두드러진 특징을 정량화합니다. 일반적으로 Ca²⁺ 신호를 분석하기 위해 로컬 또는 글로벌 Ca²⁺ 반응을 나타내는 셀의 빈도, 이러한 응답의 지속 시간, 진폭 및 빈도를 포함한 다양한 매개변수가 고려됩니다. Shigella 및 지역 반응의 경우, 분석의 또 다른 중요한 측면은 박테리아 침입 부위와 반응의 공간적 연관성입니다.
2. 전역 또는 국소 반응을 보이는 반응 세포의 비율을 정량화하려면 Fluo-4 intensity의 변화에 해당하는 시계열로 세포의 ROI를 그립니다.
   1. 거짓 긍정을 피하기 위해 평균 형광 강도 세포 기준선의 배경 변화보다 3배 높은 진폭 또는 최소 200ms의 지속 시간과 같은 국소 Ca²⁺ 반응을 식별하기 위해 엄격한 매개변수를 설정합니다.
      메모: 일반적으로 작은 로컬 Ca²⁺ 응답도 프로필로 배경 소음과 구별할 수 있습니다. ROI는 국소 변동을 감지할 수 있을 만큼 충분한 형광 신호를 통합할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. Fluo-4 검출 강도에 따라 이러한 ROI는 직경이 2 - 5mM 인 원에 해당할 수 있습니다.
   2. 동일한 세포의 고유한 영역에 있는 2개 영역에서 평균 Fluo-4 형광 강도의 변화를 측정하여 반응이 국소적인지 글로벌한지 확인합니다.
      메모: 많은 수의 세포에 대한 분석은 이미징 소프트웨어를 사용하여 촉진되며, 선택한 영역에 대한 시간 경과에 따른 평균 형광 강도의 변화를 온라인 화면에 표시할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 이미징 소프트웨어에는 이러한 옵션이 있지만 ROI Intensity Evolution 플러그인을 사용하여 Icy 프리웨어를 사용하여 수행할 수도 있습니다.
   3. 로컬 반응을 보이는 셀의 백분율을 확인합니다.
      메모: 이 비율은 현미경 분야에서 분석된 총 세포 수에서 계산되며, 이는 비모수 테스트를 사용하여 통계적 유의성을 뒷받침하기에 충분한 수여야 합니다.
   4. 로컬 응답의 지속 시간을 확인합니다.
      메모: 국소 Ca²⁺ 반응은 지속 범위(즉, 500ms 미만, 5-10초 사이 또는 10초 이상) 및 Shigella 침입 사이트와의 연관성에 따라 추가로 구별할 수 있습니다.
3. 반응의 진폭을 정량화합니다. 먼저, 2.1.7단계에서 결정된 최대 Ca²⁺ 및 세포 배경 수준을 보정합니다. Fluo-4 부하가 각 세포마다 다를 수 있으므로 현장의 개별 세포에 대해 이러한 측정을 수행합니다.
   1. 반응의 진폭을 최대 반응의 상대적 백분율로 표현합니다.
   2. 정규성 검정을 사용하여 통계적 검정을 수행한 다음 파라메트릭 검정을 수행하여 표본 간 응답 진폭의 전위차를 분석합니다.
   3. 해당 위상차 이미지에서 시각화된 박테리아 유도 멤브레인 주름에 대한 각각의 국소화를 통해 박테리아 침입 부위와 관련된 이러한 반응의 연관성을 결정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플루오-4 AM	인비트로젠	F14201
메타모프 버전 7.7	범용 이미징
CoolLED 조명 시스템 pE-2	로퍼 사이언티픽
마이크로 접시 35mm, 높이	이비디	81156
트립티카제 소이(TCS) 육수	써모피셔	B11768
TCS 한천	써모피셔	B11043
콩고 레드	시그마-알드리치	75768
M90T-아파에(APA)	Sun 외 2017		AfaE 부착물을 발현하는 Shigella flexneri serotype V.
ipgD-아파에(영어	Sun 외 2017		AfaE 부착물을 발현하는 Isogenic ipgD 돌연변이 균주