이미징 유세포 분석을 사용한 인간 T 세포와 SEB 탑재 라지 세포 간의 면역 시냅스 분석

초록

출처: Wabnitz, G. et al., 이미징 유세포 분석을 사용한 인체 시스템의 면역 시냅스의 정성적 및 정량적 분석. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 정제되지 않은 범백혈구 제제의 T 세포와 황색포도상구균 장독소 B, SEB가 로드된 라지 세포 사이의 면역 시냅스 형성을 분석합니다. CD3 및 F-액틴 농축은 이미징 유세포 분석을 사용하여 면역 시냅스에서 관찰됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 범백혈구의 준비

1. 건강한 기증자(또는 환자)의 말초 혈액 1mL를 헤파린 주사기에 담아 채취합니다. 헌혈에 대한 책임 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다.
2. 50mL 튜브에 인간 말초 혈액 1mL와 ACK 용해 완충액 30mL(150mM NH_4Cl, 1mM KHCO₃ 및 0.1mM EDTA, pH 7.0)를 혼합하고 실온에서 8분 동안 배양합니다.
3. 튜브에 PBS를 채우고 300 x g에서 6분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 펠릿을 30mL의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다.
4. 상등액이 투명해질 때까지 1.2단계와 1.3단계를 반복합니다. 마지막으로, PBS에서 세포를 세척하고 실온에서 6분 동안 300 x g에서 원심분리한 다음 세포 펠릿을 2mL의 배양 배지(RPMI1640 + 10% FCS)에 재현탁합니다. 세포를 37°C에서 60분 동안 배양합니다.

2. SEB로 Raji 셀 불러오기

1. 튜브당 1.5 x 10⁶ Raji cell이 있는 15mL Falcon 튜브 2개를 준비합니다. 세포를 스핀다운(실온에서 6분 동안 300 x g)하고 상층액을 버립니다.
2. 잔류 배지(약 50–100 μL)에 세포를 재현탁하고, 1.9 μL(1.9 μG) SEB를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 배양합니다.배양 배지 5mL를 추가하고, 세포를 스핀다운하고(실온에서 6분 동안 300 x g), 펠릿을 1 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 배양 배지(RPMI1640 + 10% FCS)에 재현탁합니다.

3. 면역 시냅스 유도 및 염색 프로토콜

1. SEB 로딩된 Raji 세포를 FACS 튜브에 500μL씩 준비하고, 500μL를 다른 FACS 튜브에 로드되지 않은 Raji 세포를 준비합니다. 각 튜브에 650μL의 범백혈구를 추가하고 세포를 스핀다운합니다(실온에서 10분 동안 300 x g). 상층액을 버리고 펠릿을 150μL의 배양 배지(RPMI1640 + 10% FCS)에 재현탁합니다. 37 °C에서 배양합니다 (일반적으로 45 분 동안).
2. 세포를 부드럽게 와류(1,000rpm에서 10초)하고 소용돌이 동안 1.5mL의 파라포름알데히드(1.5%)를 첨가하여 세포를 고정합니다. PBS 1mL + BSA 1%를 첨가하여 고정을 중지합니다. 세포를 펠렛화하고(실온에서 10분 동안 300 x g) 실온에서 10분 동안 배양한 후 1mL의 PBS + 1% BSA에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
3. 펠렛(실온에서 10분 동안 300 x g)하고 실온에서 15분 동안 100μL의 PBS + 1% BSA + 0.1% 사포닌에 세포를 재현탁시켜 세포를 투과화합니다(96웰 플레이트, U자형).
4. PBS + 1% BSA + 0.1% 사포닌에서 원심분리(실온에서 10분 동안 300 x g)로 세포를 세척하고 형광단 표지 항체 또는 화합물(CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) 및 DAPI (1:3,000))를 함유한 PBS + 1% BSA + 0.1% 사포닌 50μL에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
5. 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양하고 PBS 1mL + 1% BSA + 0.1% 사포닌을 첨가하여 세포를 3회 세척합니다. 실온에서 300 x g에서 10분 동안 원심분리기. 유세포 분석 이미징을 위해 60μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

4. 유세포 분석기를 사용한 이미지 획득

참고: 다음 이미지 획득 절차 및 데이터 분석은 imagestream(IS100), INSPIRE 및 IDEAS와 같은 소프트웨어를 사용한 이미징 유세포 분석을 기반으로 합니다. 그러나 다른 유세포 분석기 및 분석 소프트웨어도 사용할 수 있습니다.

1. 이미징 유세포 분석기에 연결된 컴퓨터에서 분석 소프트웨어를 열고 기기 메뉴에서 Initialize Fluidics를 클릭합니다. 메시지가 표시되면 오른쪽 포트에 구슬을 적용합니다.
2. File 메뉴에서 기본 템플릿을 로드하고 Run/Setup을 클릭합니다. 보기 드롭다운 메뉴에서 Beads를 선택합니다.
3. 표시된 값이 200 미만인 경우 Set Intensity를 클릭하여 명시야 조명기를 조정합니다.
4. Assist 탭에서 Start All을 클릭하여 교정 및 테스트 루틴을 실행합니다.
5. Flush/Lock/Load를 클릭하고 메시지가 표시되면 왼쪽 포트에 샘플을 적용합니다. 유세포분석기에 셀을 로드한 후 Cell Classifier를 열고 각 채널에 대해 피크 강도 상한을 1,022, 채널 2(DAPI) 및 채널 5(CD3-Pe-TxR)에 대해 피크 강도 하한을 50, 채널 1(측면 산란)에 대해 면적 하한을 50, 채널 1(측면 산란)을 위한 면적 하한을 1,500으로 조정합니다.
6. 설정 탭에서 여기 레이저 출력을 405nm(15mW), 488nm(200mW) 및 647nm(90mW)로 변경합니다.
7. 보기 드롭다운 메뉴를 셀과 비드 사이로 전환하여 셀 분류기와 레이저 파워 조정을 평가합니다.
   메모: Cell View에서 모든 세포와 세포 커플이 발견되고 세포 분류기 및/또는 여기 레이저 파워를 변경하여 포화 픽셀이 있는 세포 덩어리, 파편 및 이미지가 Debris View에서 발견되는지 확인합니다.
8. Setup 탭에서 샘플 이름과 획득할 이미지 수(샘플의 경우 15,000–25,000개, compensation control의 경우 500개)를 정의합니다. Run/Setup을 클릭하여 획득을 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
멀티퍼지 3 SR	헤레우스
RPMI 1640	라이프테크놀러지	#11875085	500 밀리리터
증권 시세	팬 생명공학 #3302-P101102
폴리스티렌 라운드 바닥 튜브	송골매	#352054	5 밀리리터
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	시그마	D8662
소 세럼 알부민	로스	#의 8076.3
사포닌	시그마	S7900
파라포름알데히드	시그마 알드리치	#의 16005
스피드 비드	암니스	#400041
미니셰이커 MS1	IKA 작품	석사1
마이크로타이터 플레이트	Greiner 바이오 원	#650101	96유
엔테로톡신 SEB	시그마 알드리치	S4881
다피	시그마 알드리치	D9542	1-3,000 비율
CD3-PeTxR	인비트로젠	MHCD0317	1 대 30 비율
팔로이딘-AF647	분자 프로브	A22287	1:1 50 비율
IS100	암니스		이미징 유세포 분석기
아이디어	암니스		소프트웨어
영감	암니스		소프트웨어

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