중간엽 줄기세포에 의한 대식세포 식세포작용(macrophage phagocytosis)의 조절을 연구하기 위한 분석

초록

출처: Evans, J. F., et al. 대식세포 식세포작용의 중간엽 줄기세포 조절; 정량 분석 및 이미징. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 공동 배양에서 대식세포 식세포작용의 중간엽 줄기세포(MSC) 조절을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. MSC를 대식세포와 공동 배양할 때, pH에 민감한 형광단에 접합된 비옵소니즈(non-opsonized) 자이모산 입자가 첨가되어 대식세포에 의해 식세포화됩니다. phagocytosis가 증가함에 따라 형광 강도가 증가하여 식세포 활성의 MSC 매개 조절을 결정할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 모든 배지 준비 및 세포 배양 기술은 층류가 있는 생물 안전 캐비닛을 사용하여 무균 조건에서 수행됩니다. 설명된 모든 배양 배양 단계는 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도의 분위기를 유지하도록 설계된 인큐베이터를 사용하여 수행됩니다.

1. 세포 배양

1. 성장 배지의 준비
   1. MSC(중간엽 줄기세포) 및 LADMAC(마우스 골수 유래 대식세포, 세포주를 확립한 연구자의 이름인 Laskin, Dower, Malech에서 파생됨)의 경우 500mL의 고혈당 DMEM(Dulbecco의 변형된 Eagle 배지)에 FBS 50mL와 100x 항생제/항진균제 혼합물 5mL를 추가합니다.
   2. 대식세포(MΦ)의 경우 FBS 50mL, LADMAC 조건 배지 100mL(섹션 1.2의 단계에 따라 준비) 및 100x 항생제 혼합물 5mL를 500mL의 고혈당 DMEM.
      에 추가합니다. 메모: LADMAC 세포는 MΦ 세포의 성장을 지원하는 데 필요한 집락자극인자(CSF-1)를 생성합니다.
2. 공동 배양을 준비하기 위해 세포를 증식시킵니다.
   1. 냉동 스톡에서 MSC 및 MΦ 세포를 시딩하기 위해 각 세포 유형에 대해 4개의 100mm 세포 배양 처리 접시 각각에 섹션 1.1에서 준비한 적절한 성장 배지 9mL를 평형화하고 세포 배양 인큐베이터에 15분 동안 놓습니다.
   2. 한편, 10⁶ 냉동 세포의 부분 표본을 37 °C 수조에서 2-3 분 동안 또는 방금 해동 될 때까지 배양하여 빠르게 해동합니다. 그런 다음 해동된 MSC 세포를 9mL의 새로운 MSC 성장 배지에 추가하고 해동된 MΦ 세포를 15 또는 50mL 멸균 원뿔형 튜브의 9mL의 새로운 MΦ 성장 배지에 추가하고 스윙 버킷 로터에서 125 x g으로 5분 동안 원심분리합니다.
   3. 상층액을 흡인 또는 디캔팅하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 적절한 신선 성장 배지 4mL에 각 펠릿을 재현탁합니다. 1.2.1단계에서 평형을 이룬 각 세포 유형에 대해 4개의 100mm 접시 각각에 1mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
   4. 세포가 있는 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 70%-80%가 합류할 때까지 2-3일마다 매체를 교체하십시오.

2. 실험 요리에 MSC 파종, 1일차

참고: MSC를 파종하기 전에 형광 분광 광도계를 위한 실험용 96웰 플레이트 레이아웃과 동적 이미징을 위한 챔버 슬라이드를 설계하십시오. 96웰 플레이트의 경우, 세포가 포함된 웰이 있는 실험용 웰의 측면에 배치하되 분석에는 사용하지 마십시오. 시약 블랭크(RBL)에 사용할 웰을 4개 이상 표시합니다. 96웰 템플릿의 예는 표 1을 참조하고, 4웰 챔버 슬라이드 템플릿의 예는 표 2를 참조하십시오. 바닥이 투명한 검은색 또는 흰색 96웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 1.5mm 붕규산 유리 챔버 슬라이드가 최적이지만 챔버 수는 연구 설계에 따라 조정할 수 있습니다. 다음 방법의 요약 순서도는 그림 1에 포함되어 있습니다.

1. 70%-80% 농도에서 100mm 접시의 배양물에서 성장 배지를 흡인하고 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하여 MSC를 분리합니다.
2. PBS를 흡인하고 0.05% 트립신/EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 2mL를 첨가한 다음 배양 인큐베이터에 3-5분 동안 넣습니다.
3. 3분 후 도립 현미경을 사용하여 세포 분리를 확인합니다. 셀이 분리된 경우 다음 단계를 계속합니다. 그렇지 않은 경우 1-2분 더 배양을 계속합니다. 5-6분 이상 배양하지 마십시오.
4. 분리된 세포가 있는 접시에 신선한 성장 배지 5mL를 추가합니다. 트립신/배지 혼합물을 사용하여 접시를 헹구고 멸균 혈청학 피펫을 사용하여 깨끗하고 멸균된 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다.
5. 125 x g에서 5분간 원심분리기. 상층액을 흡입하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 10mL의 신선한 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
6. 세포를 계수하려면 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 30μL의 0.4% 트리판 블루 용액에 10μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 그런 다음 혈구계 계수 챔버의 커버슬립 아래에 혼합물 10μL를 피펫팅합니다.
7. 10x 대물렌즈와 함께 도립 현미경 또는 명시야 현미경을 사용하여 1mm² 정사각형 중 4개에서 염색되지 않은(생존 가능한) 세포를 계수합니다. 다음 공식을 사용하여 세포 수를 계산합니다: cells/mL = cell count/# 1 mm² squares x dilution factor x 10⁴.
   메모: 이 예에서 계산된 1mm² 제곱의 수는 4이고 희석 계수는 4입니다.
8. 방정식 C₁V₁ = C₂V₂를 사용하여 1 x 10⁵ cell/mL 현탁액을 계산하고 준비합니다. 플레이트 설계에 따라 충진할 96웰 플레이트의 모든 컬럼에 대해 1mL의 셀/mL 현탁액을 준비하고 4웰 챔버 슬라이드의 모든 챔버에 대해 0.75mL를 채웁니다.
   메모: C₁ = 세포 수, V₁ = 계산 중인 항목, C₂ = 1 x 10⁵, V₂ = 5.50mL.
9. V₁을 결정하고 총 부피의 원하는 5.50mL에서 빼서 현탁액을 준비하는 데 필요한 신선한 배지의 부피를 결정합니다. 원래 현탁액의 세포 부피(_V1)를 1 x 10⁵ cells/mL로 총 5.50mL의 새 배지 부피에 추가합니다.
10. 다채널 마이크로 피펫터를 사용하여 플레이트 설계에 따라 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 1 x 10⁵셀/mL 현탁액을 추가하고 플레이트 설계에 따라 마이크로피펫을 사용하여 챔버 슬라이드의 각 웰에 530μL를 추가합니다. 하룻밤 동안 배양하십시오.
    메모: 이 실험에서 MSC는 96웰 플레이트의 열 1, 2, 3 및 6(표 1)과 4웰 챔버 슬라이드의 웰 1 및 2(표 2)에 도금됩니다. 따라서 최소 5.50mL의 1 x 10⁵ cell/mL 현탁액이 준비됩니다. 80% 합류 지점에서의 MΦ는 MSC가 실험 플레이트에 파종된 당일에 염증 매개체로 처리됩니다.

3. MΦ 분리 및 공동 배양 준비, 2일차

1. MΦ 세포에서 활성화 배지를 제거하고 5mL의 신선한 성장 배지로 교체합니다. 세포 리프터로 부드럽게 긁어내고 세포를 50mL 원뿔형 튜브에 모읍니다.
2. MSC에 대해 설명된 대로 트리판 블루 배제 및 혈구 측정법을 사용하여 세포 계수 2.6-2.7 단계를 수행합니다.
3. 단계 2.8-2.9의 방정식을 사용하여 2 x 10⁵ cells/mL의 두 개의 개별 현탁액을 준비하는데, 하나는 대조군의 세포이고 다른 하나는 처리된 MΦ 배양의 세포입니다.
   메모: 플레이트 설계에 따라 채울 96웰 플레이트의 모든 컬럼에 대해 1mL의 셀/mL 현탁액을 준비하고 4웰 챔버 슬라이드의 모든 챔버에 대해 0.75mL를 채웁니다.
4. MSC를 포함하는 96웰 플레이트의 실험용 웰에서 배지를 부드럽게 흡입합니다. 멀티채널 마이크로피펫을 사용하여 플레이트 설계에 따라 MSC가 있거나 없는 적절한 실험 웰에 처리된 MΦ 세포 현탁액 100μL를 추가합니다. 하룻밤 동안 배양하십시오.
5. MSC를 포함하는 4-웰 챔버 슬라이드에서 배지를 부드럽게 흡입하고, 마이크로피펫을 사용하여 530μL의 MΦ 세포 현탁액을 설계에 따라 적절한 웰에 추가합니다. 하룻밤 동안 배양하십시오.

4. 식세포작용 분석, kinetic 형광 96웰 플레이트 판독, 3일차

1. 분석 파라미터 설정
   1. 분석 당일에는 형광판 판독기를 켜고 시스템의 온도를 37°C로 컴퓨터 설정합니다.
   2. System Pro 소프트웨어를 열고 왼쪽 상단 모서리에 있는 기기 아이콘을 확인하여 기기가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다. 선이 있는 빨간색 원이 보이면 기기 아이콘을 클릭하고 팝업 창에서 기기를 선택하여 연결합니다.
   3. New Experiment를 선택하여 Plate Set-Up Helper 팝업 창에 액세스합니다. Plate Set-Up Helper 메뉴에서 Configure Your Acquisition Settings를 선택합니다.
   4. 광학 구성을 위한 설정 메뉴에서 Monochromator를 선택합니다. 읽기 모드로 FL(형광)을 선택하고 읽기 유형으로 Kinetic을 선택합니다.
   5. 동일한 구성 창의 Category(범주)에서 Wavelengths(파장)를 클릭한 다음 excitation(여기)의 경우 bandwidths(대역폭)를 9nm, emission(방출)의 경우 15nm로 설정합니다.
   6. Number of Wavelength Pairs(파장 쌍 수)를 1로 설정합니다. 여기(excitation)의 경우 파장 LM1을 510nm로, 방출의 경우 540nm로 설정합니다.
   7. 범주를 계속 진행하고 다음으로 플레이트 유형을 선택합니다. 사용 중인 플레이트 유형과 일치하는 옵션을 선택합니다.
      메모: 선택 항목이 플레이트 유형과 일치하는 것이 중요합니다. 판독 높이는 선택에 따라 시스템에 의해 설정됩니다.
   8. 다음으로, Read Area를 선택하고 실험 설계에 포함된 96웰 플레이트의 영역을 강조 표시합니다.
   9. PMT 및 Optics를 선택하고 PMT Gain을 High로 설정하고 Pacts per read를 6으로 설정합니다. 투명 바닥 플레이트를 사용하는 경우 Read from Bottom(바닥에서 읽기) 옆의 확인란을 선택합니다.
   10. 타이밍을 선택하고 70분 동안 10분 간격으로 설정합니다.
   11. Shake를 선택하고 Before First Read 상자를 선택한 다음 5초로 설정합니다. Between Reads 상자를 선택하고 3초로 설정합니다. 둘 다에 대한 흔들림 강도를 Low 및 Linear로 설정합니다.
   12. 창을 닫습니다. Plate Set-Up Helper 창이 나타나면 Plate Layout 구성을 선택합니다. 플레이트 설계의 BL 웰을 강조 표시하고 Plate Blank를 클릭합니다.
   13. 각 실험 행을 강조 표시하고, 추가를 클릭하고, 그룹 이름을 지정한 다음, 색상을 선택합니다.
   14. 플레이트 디자인 아래의 Assignment Options(할당 옵션)에서 Series(시리즈)를 선택한 다음 창에서 시리즈를 정의하고 OK(확인)를 클릭합니다. 각 그룹에 대해 반복합니다.
2. zymosan 현탁액을 준비합니다.
   1. 시스템 온도가 37°C에 도달할 때까지 기다리는 동안 5mL의 라이브 셀 이미징 배지에 1mg의 자이모산 입자를 재현탁합니다.
      1. 입자가 들어 있는 바이알에 1mL의 생세포 이미징 배지를 추가하고 유리 배양 튜브에 수집합니다. 추가로 1mL의 이미징 용액으로 바이알을 헹구고 동일한 유리관으로 옮겨 모든 입자가 전달되도록 합니다. 3mL의 이미징 용액을 추가로 추가하면 0.2mg/mL의 입자 현탁액을 얻을
      수 있습니다.
   2. 30-60초 동안 빠른 펄스를 가진 소용돌이. 그런 다음 프로브 초음파 처리기를 사용하여 60개의 빠른 펄스로 초음파 처리합니다.
      메모: 입자의 균일한 현탁액을 만들고 실험용 웰에 추가하기 전에 현탁액을 너무 오래 두지 않는 것이 매우 중요합니다. 뭉침이 빠르게 재발합니다. 셀당 입자 밀도는 사용된 MΦ의 소스, 처리 및 밀도에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 제시된 연구에서는 공액 자이모산 입자가 사용되었습니다. 그러나 공액 대장균 및 S. 아우레우스도 사용할 수 있습니다.
3. zymosan을 추가하고 플레이트를 읽습니다.
   1. 실험용 웰에서 배지를 흡입하고 100μL의 생세포 이미징 솔루션으로 1x를 헹굽니다. RBL 웰도 라이브 셀 이미징 솔루션으로 헹굽니다.
   2. 실험용 웰 및 RBL 웰에서 라이브 셀 이미징 용액을 흡입하고 100μL의 자이모산 입자 현탁액으로 교체합니다.
   3. 터치패드 인터페이스를 사용하여 형광 판독기의 플레이트 트레이를 엽니다. 뚜껑이 없는 플레이트를 A1 웰이 왼쪽 상단 모서리에 있는 트레이에 넣습니다. 터치패드를 사용하여 트레이를 닫고 상단 메뉴에서 녹색 읽기 버튼을 클릭합니다.
   4. 읽기가 완료되면 파일을 해당 폴더에 저장하고 파일을 클릭하고 내보내기를 선택하여 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보냅니다.
   5. 스프레드시트(보충 파일 1)의 각 시점(10분, 20분, 30분 등)에서 각 반복 실험 그룹에 대한 평균 ± SEM 상대 형광을 계산하고 데이터를 그래프 소프트웨어로 전송합니다.
   6. 선 그래프 형식을 사용하여 데이터를 제시하고 양방향 분산 분석(Time x Treatment/MSC as factors)을 적용한 다음 Tukey의 다중 비교 검정을 적용하여 개별 그룹 간의 차이를 확인합니다.
      메모: 96웰 플레이트 판독이 진행되는 동안 타임 랩스 이미지 획득을 위해 동적 이미징 플레이트를 준비합니다. 동적 이미징이 한 번에 하나의 실험 웰에 대한 분석을 진행하는지 확인합니다.

표 1: 96웰 플레이트 설계의 예. CBL - 셀 블랭크; MSC - 1일차 시드 배정; MΦ+ 치료 및 MΦ 미처리 파종 2일차; 분석 3일차에 RBL 시약 블랭크가 추가되었습니다.

개 개 개 개 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기 표시기 표시기 증권 시세 표시기

	1	2	3	4	5	6	7
ᅡ	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
비	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
씨	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
디	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
E	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
에프	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
지	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL
H	증권 시세	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+	증권 시세	RBL

표 2: 4웰 챔버 슬라이드 설계의 예. MSC - 도금 1일차; MΦ+는 대우하고 MΦ는 도금하지 않는 일을 처리했습니다 2.

개 개 개

1	2	3	4
MSC/MΦ	MSC/MΦ+	엠피니케이트	엠φ+

결과

그림 1: co-culture 및 phagocytosis assay workflow의 개요. MSC와의 공동 배양에서 MΦ phagocytosis 활성의 정량적 및 정성적 분석을 위한 워크플로우의 개요.

Supplementary File 1: 최적 실험의 원시 운동 데이터를 담은 대표적인 스프레드시트 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
96웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트	밀리포어시그마	CLS3603-48개
0.4% 트리판 블루 용액	밀리포어시그마	T8154-20ML
15 mL 및 50 mL 코니컬 멸균 폴리프로필렌 원심분리 튜브	써모피셔	339653
항생제-항진균제(100X) Gibco	써모피셔	15240096
세포 리프터	밀리포어시그마	CLS3008-100개
배양 플라스크, 조직 배양 처리, 표면적 75cm2, 경사진 목, 캡 포함, 여과	밀리포어시그마	C7231-120개
D1 ORL UVA [D1]	증권 시세	CRL-12424	마우스 MSC 세포주
DMEM, 고혈당	써모피셔	11965092
Fetal Bovine Serum, 유자격, 열비활성화	써모피셔	16140071
혈구계	피셔사이언티픽	02-671-51B
I-11.15	증권 시세	CRL-2470	마우스 MΦ 세포주
LADMAC 세포주	증권 시세	CRL-2420	LADMAC 세포는 성장인자 콜로니 자극 인자 1(CSF-1)을 분비합니다.
Live-Cell Imaging 솔루션	써모피셔	A14291DJ
PBS, pH 7.4	써모피셔	10010031
pH Rhodo Green Zymosan 바이오 입자 접합체	써모피셔	P35365 (영문
스펙트라맥스 i3X	분자 장치
멸균 일회용 진공 필터 장치, 250 mL, 0.2 μm	써모피셔	568-0020
멸균 주사기 필터, 0.2마이크로미터	써모피셔	Tel.: 723-2520
조직 배양 처리 된 배양 접시, 100mm x 20mm	밀리포어시그마	CLS430167-100개
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	써모피셔	25300054

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