Electroporation에 의하여 포유류 세포로 Bacterial Effector 단백질의 소개

초록

출처: Sontag, R. L. et al., 포유류 세포로의 기능성 박테리아 효과기의 전기천공법. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오에서는 전기천공법을 통해 박테리아 효과기 단백질을 포유류 세포에 도입하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 effector 단백질의 세포 내 국소화는 특정 형광단 접합 항체로 염색한 후 컨포칼 현미경 검사에 의해 검출됩니다.

프로토콜

1. 전기충격법

1. 400μl의 세포 현탁액을 미리 냉각된 큐벳에 넣고 선택한 단백질 20μg(50μg/ml)을 큐벳에 추가합니다.
2. 큐벳을 부드럽게 ~10회 튕겨 세포를 손상시키지 않고 섞습니다. 메모: 큐벳을 여러 번 뒤집어 완전히 혼합할 수도 있지만 세포 손상을 방지하기 위해 위아래로 피펫을 피플하거나 소용돌이치지 마십시오.
3. 종이 타월이나 다른 와이퍼로 큐벳 외부를 건조시켜 전기천공기에서 전기 아크를 방지합니다.
4. 0.3kV에서 1.5-1.7msec 동안 전기 천공물 샘플.참고: 이것은 이 연구에서 일반적이었습니다.
5. 전기천공 직후 큐벳을 부드럽게 ~10회 튕겨 완전히 섞습니다.

2. 세포의 도금

1. 회수 플레이트에 넣을 준비가 될 때까지 전기천공된 세포가 있는 큐벳을 얼음 위에 보관합니다.
2. 대부분의 다운스트림 분석의 경우, 사전 예열된 NGM으로 셀을 1x 세척하여 외부 effector 단백질을 제거합니다.
   1. 분석을 위해 세포를 제거하고 3-5ml의 NGM에 현탁합니다.
   2. 900 x g에서 4분 동안 원심분리하여 펠렛 세포를 만듭니다.
   3. 원하는 플레이트 크기에 대해 적절한 양의 NGM에 재현탁합니다(예: 35mm 접시의 경우 2ml).
3. 다운스트림 분석을 위해 적절한 양의 셀을 제거합니다.
   1. 예 1: 현미경 분석을 위해 유리 바닥 접시에 플레이트를 만듭니다.
   2. 예 2: 친화성 정제와 같은 단백질 분석을 위해 세포 배양 플라스틱에 플레이트를 삽입.
4. 세포가 37°C에서 최소 4시간 동안 가습된 95% 공기/5% CO₂ 대기의 평형 플레이트에서 회복되도록 합니다.

3. 현미경 분석

1. 고정/면역형광 염색
   1. 4시간의 회복 기간 후 멸균 PBS로 셀을 1x 세척합니다.
   2. 실온에서 100% 메탄올로 2분 동안 세포를 고정합니다. 세포를 완전히 덮을 수 있도록 충분한 메탄올을 사용합니다(예: 35mm 접시의 경우 2ml).
   3. 멸균 PBS로 3회 세척합니다.
   4. PBS에서 0.4% Triton X-100으로 15분 동안 세포를 투과합니다. 예를 들어, 직경 35mm 플레이트에 1ml를 사용합니다.
      1. Triton X-100의 투과화 길이와 강도를 epitope와 타겟 단백질의 위치에 따라 조절합니다. 메모: 최상의 결과는 각 표적에 대해 경험적으로 결정되어야 하지만, 위의 조건은 대부분의 세포질 표적에 적합해야 합니다.
   5. RT에서 1시간 동안 PBS에서 5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단합니다. 예를 들어, 직경 35mm 플레이트에 1ml를 사용합니다.
   6. PBS로 3회 세척합니다.
   7. 항체 결합 용액(PBS의 0.1% Triton X-100 및 1% BSA)에 기본 항체를 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 예를 들어, 35mm 직경의 플레이트에는 0.5ml를 사용합니다.
      1. 항체 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 메모: 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드 태그(SBP-tag) 항체는 1:1,000 희석으로 사용되었고, PKN1 항체는 1:200 희석으로 사용되었습니다.
   8. PBS로 4x 세척합니다.
   9. 항체 결합 용액에 적절한 형광 접합 2차 항체를 넣고 빛으로부터 보호하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      1. 예를 들어ample, Alexa 488 또는 Alexa 647을 실온에서 1시간 동안 사용합니다.
         1. 항체 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. (예: 이 연구의 경우 약 1:1,000).
      2. 예를 들어, 제조업체의 권장 사항에 따라 Alexa 647 또는 DAPI에 접합된 5μM 밀 배아 응집소(WGA)와 같은 다른 염색을 실온에서 1시간 동안 추가합니다.
   10. PBS로 5회 세척하고 4°C에서 보관하며, 이미징할 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신-EDTA 용액	셀그로	25-050-CL
0.4cm 갭 일회용 electroporation 큐벳	바이오 라드	165-2088
100% 메탄올	어떤	해당 사항 없음	가연성, 독성
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A4919
Cell Counting Apparatus - 혈구계 또는 Coulter Counter	벡크만 쿨터	모델 Z1
세포 배양 인큐베이터	어떤	해당 사항 없음	37°C에서 95% 공기/5% CO2 대기압 가습
세포 배양 플라스틱	어떤	해당 사항 없음	세포 배양 플라스크/플레이트, 피펫, 튜브, 고무 경찰관
Dulbecco의 독수리 매체 변형 (DMEM)	셀그로	제10-013	37 °C로 데우기
전기포레이터	바이오 라드	대장균 펄서
소 태아 세럼(FBS)	셀그로	35-016-이력서
형광 컨포칼 현미경	지에스	모델 LSM 710
현미경 검사를위한 유리 바닥 접시	윌코 웰스	HBSt-3522
HeLa 세포주	증권 시세	ATCC CCL-2
최소 필수 매체(MEM)	셀그로	제10-010	37 °C로 데우기
퇴색 방지 시약과 함께 다른 형광 염색(WGA, DAPI)	어떤	해당 사항 없음
페니실린/스트렙토마이신	셀그로	30-002-CL
RAW 264.7 세포주	증권 시세	TIB-71
관심 대상에 대한 1차 항체	어떤	해당 사항 없음
Fluorophore에 접합된 2차 항체	어떤	해당 사항 없음
인산염 완충 식염수	어떤	해당 사항 없음	4 °C로 냉각
멸균 인산염 완충 식염수	어떤	해당 사항 없음	37 °C로 데우기
원뿔형 튜브를 수용할 수 있는 탁상용 원심분리기(스윙 버킷 선호)	어떤	해당 사항 없음
트리톤 X-100	시그마-알드리치	T8585	자극성, 독성