쥐 모델에서 Malassezia-Induced Skin Inflammation and Fungal Burden Analysis (말라세지아에 의한 피부 염증 및 곰팡이 부담 분석)

초록

출처: Sparber, F. et al., 곰팡이-숙주 상호작용을 연구하기 위해 Malassezia spp.로 생쥐 감염.J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 쥐의 말라세지아로 인한 피부 감염을 보여줍니다. 말라세지아 오일 현탁액을 상처 입은 귀에 바르면 귀 조직의 염증과 부종을 유발합니다. 나중에, 귀는 절개되고, 균질화되고, 성장을 위해 한천 판에 퍼집니다. 군집의 수는 피부 염증으로 인한 곰팡이 부담을 나타냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 실험실 조건에서의 말라세지아 배양

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약과 매체는 낮은 온도가 곰팡이 성장을 억제할 수 있으므로 달리 명시되지 않는 한 실온(RT, 20 – 25 °C)에서 보관하십시오.

1. 말라세지아 성장을 위해 액체 변형 딕슨(mDixon) 배지를 준비합니다. 500mL의 액체 mDixon 배지를 준비하려면 맥아 추출물 18g, 건조 옥스담즙 10g, Tween-40 5mL, 펩톤 3g, 글리세롤 1mL 및 올레산 1mL를 500mL 증류된 H₂O(dH₂O)에 용해시킵니다. HCl 및 오토클레이브를 사용하여 매체를 pH 6으로 조정합니다. RT에서 매체를 저장합니다.
2. 오토클레이빙 전에 500mL mDixon 배지에 7.5g의 한천을 첨가하여 mDixon 한천 플레이트를 준비합니다. 스티어링 바와 자기 가열판을 사용하여 오토클레이빙 후 mDixon 한천을 천천히 냉각시켜 냉각하는 동안 매체의 부분적인 응고를 방지합니다.
3. 한천이 50 – 60 ° C로 냉각되면 액체를 층류 후드의 페트리 접시에 분배하고 RT에서 밤새 건조시킵니다.
   메모: 한천 플레이트는 증발을 방지하기 위해 포장하고 거꾸로 보관할 때 몇 주 동안 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
4. 공급자가 얻은 지침에 따라 Malassezia 분리를 얻고 동결 건조된 Malassezia 재고를 되살립니다.
5. 제공자가 얻은 지침에 따라 멸균 100mL 삼각 플라스크에 10mL의 액체 mDixon 배지를 되살린 Malassezia 현탁액을 접종합니다. 30 °C 및 180 rpm의 진탕 인큐베이터에서 배양물을 배양합니다.
6. 크림 색과 탁도의 모양을 확인하여 Malassezia 배양의 성장을 정기적으로 검사하십시오. 성장 역학은 Malassezia의 종과 균주에 따라 다르며 Malassezia가 동결 건조된 주식에서 갓 부활할 때 특히 느릴 수 있습니다. (그림 1A).
7. mDixon 배지에서 조밀하게 성장한 Malassezia 배양 3부와 멸균 99% 글리세롤 1부를 혼합하여 글리세롤 스톡을 준비합니다. 말라세지아/글리세롤 혼합물을 멸균 스크류 캡 튜브에 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
8. 체외 증식을 위해 접종 루프를 사용하여 mDixon의 액체 배양 또는 동결된 글리세롤 스톡에서 mDixon 한천 플레이트(4°C에서 RT로 가져옴)로 Malassezia 플레이트를 플레이트화합니다.
   메모: 차가운 mDixon 한천은 곰팡이 성장을 억제하므로 사용하기 전에 mDixon 한천 플레이트를 4°C에서 RT로 옮깁니다.
9. 30°C의 aN(비흔들림) 인큐베이터에서 Malassezia가 있는 한천 플레이트를 거꾸로 배양합니다. Malassezia 군체의 성장을 정기적으로 검사합니다.
   참고: mDixon 한천 플레이트의 Malassezia 군집은 3-5일 이내에 나타나며 크림색의 칙칙하고 볼록한 융기로 매끄럽습니다(그림 1B).
10. Malassezia 식민지를 RT에서 mDixon 한천 플레이트에 ~ 2 주 동안 보관하십시오. 그런 다음 1.7에 설명된 대로 냉동 글리세롤 스톡에서 Malassezia를 줄무늬로 만들어 새 mDixon 한천 플레이트를 준비합니다.

2. 생쥐의 실험적 Malassezia 감염에 대한 접종 준비

1. 멸균 100mL 삼각 플라스크에 10mL의 액체 mDixon 배지를 mDixon 한천 플레이트에서 3 - 5개의 개별 Malassezia 콜로니를 접종합니다(1단계, 그림 1B 참조).
2. 배양액이 크림색이고 탁해질 때까지 30°C 및 180rpm에서 ~ 48-96시간 동안 Malassezia 배양을 배양합니다(그림 1A).
   메모: Malassezia 성장에 필요한 시간은 Malassezia 종과 균주 및 접종에 사용되는 곰팡이의 양에 따라 다릅니다.
3. Malassezia 배양액 2mL를 멸균 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 버리고 펠릿을 1mL의 인산염 완충 염 용액(PBS)에 현탁시켜 세척합니다. 10,000 x g에서 1분 동안 다시 원심분리기를 사용합니다.
5. 세척 후 펠릿을 PBS 1mL에 격렬하게 피펫팅하여 현탁시키고 분광계를 사용하여 600nm(OD_A600)에서 용액의 광학 밀도를 측정합니다. 판독값이 0.1에서 1.
   사이가 되도록 OD 측정을 위해 PBS로 Malassezia 현탁액 20 – 50 x를 희석합니다. 메모: Malassezia의 3일 배양 밀도는 일반적으로 Malassezia 종 및 균주 및 배양액 접종에 사용되는 효모 세포의 수에 따라 15 - 30 OD_A600 사이에서 다양합니다(단계 2.1).Malassezia는 응집체를 형성하는 경향이 있으므로 현탁액의 균질성을 보장하기 위해 격렬한 피펫팅이 필요합니다.
6. 4 OD_A600의 밀도에 해당하는 PBS의 Malassezia 현탁액 부피를 멸균 2mL 튜브에 분취합니다. 감염될 동물 한 마리당 튜브 1개를 준비합니다.
7. 10, 000 x g에서 1 분 동안 Malassezia를 포함하는 관을 원심 분리하십시오.
8. 상층액을 버리고 천연 올리브 오일 200μL(OD_A600 효모 세포 2개/올리브 오일 100μl에 해당)에 Malassezia 펠릿을 현탁시킵니다.
   메모: 올리브 오일은 말라세지아(Malassezia)가 친유성 및 지질 의존성 효모이기 때문에 말라세지아(Malassezia)에 의한 표피 감염에 좋은 매개체인 것으로 밝혀졌습니다. 올리브 오일은 PBS보다 피부에 더 잘 흡수됩니다. 그러나 올리브 오일에 Malassezia를 현탁시키는 것은 쉽지 않습니다. 볼텍싱으로 Malassezia/올리브 오일 현탁액을 개선합니다. 감염에 사용될 때까지 현탁액을 RT로 유지하십시오.
9. 대조 동물의 모의 감염을 위해 올리브 오일만 든 튜브를 준비합니다.

3. 쥐를 말라세지아에 감염

1. 생후 6-8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 주문하고 최소 1주일 동안 실험 동물 시설에 적응할 수 있도록 합니다. 감염되지 않은 대조군을 포함하여 그룹당 3 - 5마리의 마우스를 계산합니다.
2. PBS에 1.3mg/mL의 자일라진과 6.5mg/mL의 케타민을 함유한 멸균 마취 칵테일을 준비합니다.마취 칵테일 5mL는 20마리의 동물을 마취하기에 충분합니다. 마취 할 동물의 수에 따라 칵테일의 양을 조절하십시오.
   1. 체중 10μL/g의 마취 칵테일을 복강내로 주입하여 동물을 마취하고(체중 1kg당 케타민 65mg 및 자일라진 13mg에 해당) 마취된 동물을 37°C의 가열 패드에 놓습니다.
      메모: 표시된 용량에서, 동물은 일반적으로 ~ 30 - 60 분 동안 마취 상태를 유지합니다.
3. 동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 집게로 뒷발을 꼬집어 반사 신경을 확인하십시오.
4. 마취 중 탈수를 방지하기 위해 아이 크림을 눈에 바르십시오.
5. 선택적으로 캘리퍼(0 - 5mm 범위)를 사용하여 양쪽 귀의 귀 두께를 측정합니다. 각 귀의 두 가지 다른 부위를 측정하고 귀당 평균 귀 두께를 계산합니다.
   메모: 귀 두께를 측정하는 것은 선택 사항이며 연구 질문에 따라 다릅니다. 그러나 귀 두께를 피부 염증에 대한 판독값으로 사용하는 경우 감염 전에 기준선 귀 두께를 측정해야 합니다. (4단계 참조).
6. 선택적으로, 가벼운 테이프 스트리핑으로 등쪽 귀 피부의 표피 장벽을 파괴하십시오: 피부에 작은 테이프 조각을 수동으로 붙이고 다시 제거하십시오. 각 라운드마다 새 테이프를 사용하여 5라운드를 연속으로 반복합니다.
   참고: 말라세지아는 교란되지 않은 피부보다 장벽이 파괴된 피부에서 더 뚜렷한 피부 염증을 유발합니다(그림 2A).
7. 멸균 피펫을 사용하여 Malassezia/olive oil 현탁액 100μL(2 OD_A600)를 각 귀의 등쪽에 국소적으로 도포합니다. 올리브 오일만 투여한 동물의 대조군을 포함합니다(차량 처리된 대조군).
   메모: 적용 직전에 균질한 Malassezia 현탁액을 보장하기 위해 Malassezia/올리브 오일 현탁액을 격렬하게 소용돌이
치십시오.
8. 마취된 동물을 회복의 징후(수염 움직임, 호흡 속도 증가 등)를 보일 때까지 저체온증을 피하기 위해 가열 패드에 그대로 두십시오.
9. 200μL의 멸균 및 예열된 2% 포도당 용액을 목덜미에 피하주사하여 신진대사와 수분 재생을 지원합니다.
   메모: 멸균 2% 포도당 용액을 준비하려면 50mL PBS에 포도당 1mg을 용해하고 0.2μm 필터를 사용하여 여과합니다. 용액은 4°C에서 보관할 수 있습니다.
10. 동물을 우리로 다시 옮깁니다.

4. 말라세지아로 인한 피부 염증 분석

참고: 이 절차는 피부 염증의 매개 변수 역할을 하는 감염 중 말라세지아로 인한 귀 부종을 분석하는 방법을 설명합니다. 곰팡이로 인한 귀 부종을 분석하기 위한 전제 조건은 테이프 제거 및/또는 감염 전에 기준선 귀 두께를 측정하는 것입니다(3.5단계).

1. 말라세지아 감염 및 대조 동물의 단기 마취를 위한 이소플루란 챔버를 준비합니다.
2. 한 번에 한 마리의 동물을 챔버로 옮기고 동물이 완전히 마취될 때까지 기다립니다.
   메모: 적절한 마취의 징후에는 완전한 몸 이완과 느리고 무거운(옆구리) 호흡이 포함됩니다. 이소플루란에 장기간 노출되면 치명적일 수 있으므로 마취를 주의 깊게 모니터링하십시오.
3. 챔버에서 동물을 꺼내 티슈 위에 놓습니다.
4. 캘리퍼(범위 0 - 5mm)를 사용하여 귀의 두께를 측정합니다. 각 귀의 두 가지 다른 부위를 측정하고 귀당 평균 두께를 계산합니다(3.5단계 참조).
5. 동물을 다시 우리로 옮깁니다.
   메모: 이소플루란 마취는 수명이 매우 짧고 동물은 이소플루란 챔버에서 제거한 후 ~ 30초 이내에 회복합니다.
6. 감염 후 각 시점에서 측정된 평균 귀 두께에서 테이프 벗겨짐 및/또는 감염 전에 측정된 평균 기준선 귀 두께를 빼서 귀 두께의 증가를 계산합니다.
7. 계산된 값을 귀 두께의 증가로 플롯하거나 각 동물 또는 동물 그룹의 시간 경과에 따른 총 귀 두께로 플롯합니다(그림 2B).

5. 감염된 피부의 곰팡이 부담 분석

1. dH₂O의 멸균 0.05% 노니뎃 P40(NP40) 0.5mL와 오토클레이브 강철 볼(직경 5mm)이 포함된 각 귀를 수확할 수 있는 멸균 2mL 마이크로 원심분리기 튜브를 준비합니다.
2. 정밀 저울을 사용하여 튜브의 무게를 측정하고 정확한 무게를 기록합니다.
3. CO₂ 질식으로 마우스를 안락사시킵니다.
4. 베이스에서 귀를 제거하고 5.1 - 5.2 단계에서 설명한대로 dH₂O에 0.5mL의 멸균 0.05 % NP40이 들어있는 튜브로 옮깁니다.
5. 귀 조직이 들어 있는 튜브의 무게를 측정하고 장기가 있는 튜브의 무게에서 장기가 없는 튜브의 무게를 빼서 각 샘플의 실제 무게를 계산합니다.
6. 조직 균질기를 사용하여 25Hz에서 6분 동안 귀 조직을 균질화합니다. 조직이 잘 균질화되어 있는지 확인하십시오.
7. 각 시료의 100μL(각 균질액의 1/5에 해당, 희석 계수 = 5)를 mDixon 한천 플레이트에 플레이트하고 30°C 인큐베이터에서 플레이트를 거꾸로 배양합니다.
   메모: 도금된 균질산염의 양은 예상되는 곰팡이 부하에 따라 조정되어야 합니다. 쉽게 열거할 수 있도록 플레이트당 최소 10개에서 250개 이하의 콜로니를 얻을 수 있도록 충분한 균질성을 플레이트해야 합니다. 선택적으로, 샘플당 여러 플레이트를 다양한 균질산염 희석액으로 플레이트합니다.
8. Malassezia 군집의 성장을 정기적으로 검사하십시오.
   메모: 군락은 일반적으로 2-3일 후에 볼 수 있습니다. Malassezia 군체가 성장하는 데 필요한 시간은 Malassezia의 종과 균주에 따라 다릅니다.
9. 접시당 식민지를 세십시오.
10. 다음 공식을 사용하여 집락 형성 단위, CFU/g 조직의 수를 계산합니다.
    CFU/g 조직 = (콜로니/플레이트 수) x (희석 계수) / (피부 샘플의 무게(g)).
    메모: 대략적인 최소 검출 한계는 다음 공식을 사용하여 평가할 수 있습니다: 최소 검출 한계 = (1 콜로니/플레이트) x (희석 계수) / (모든 피부 샘플의 평균 중량(g).
11. 곰팡이 부하는 일반적으로 로그 스케일로 표시됩니다(그림 2C).

결과

그림 1: 말라세지아의 체외 배양. (A) M. sympodialis 균주 ATCC 42132를 30°C 및 180rpm에서 3일 동안 액체 mDixon 배지(왼쪽)에서 배양한 후 접종하지 않은 mDixon 배지가 함유된 대조군 삼각 플라스크(오른쪽) 옆에 있습니다. (B) 30°C에서 5일간의 배양 후 mDixon 한천에 대한 M. sympodialis 균주 ATCC 42132의 집락.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천	시그마-알드리치	A1296-1KG
아타네 이소플루라네	피라말 헬스케어	-
Biosaftey 캐비닛(BSC) 더 빠르고 안전한	다싯 그룹	테크 5594	BSL2 인증
원심 분리기	에펜도르프	5415디	2ml Eppendorf 튜브와 호환 가능
Dessicated Ox-bile	시그마-알드리치	70168-100지
Eppendorf Tubes(2 ml)	에펜도르프	0030 120.094
포도당	시그마-알드리치	49159-5KG
자일세롤 (99 %)	니 웰	10314830
발열 패드	아이켄마이어	648048
인큐베이터 Hereaus B20	헤레우스	412047753	BSL2 인증
케타솔 (100 mg)	그레이웁 AG	6680416
마젠틱 가열판 MR Hei-Standard	Heidolph 악기	442-1355
말라세지아 spp.	증권 시세	14522, 14521, 42132
맥아 추출물	시그마-알드리치	70167-500지
생물권 튜브 곱하기(200 μl)	사르슈테트 AG	7084211	세이프락
천연 올리브 오일	-	-	Commerc. 사용 가능
노니뎃 P40	축삭 연구실	대답1694,0250
Oditest measurment devise	크로플린	시즌 0247	범위 : 0-5 mm
올레산	시그마-알드리치	75090-5ML
펩톤	옥소이드	LP0037
페트리 접시	사르슈테트 AG	82.1473
포스팟 완충 염 용액(PBS, 1x)	아미드/바이오컨셉	3-05F39
롬푼 (2 %)	바이엘	KP0BFHR
쉐이킹 인큐베이터 Infors Minitron	인포서	-	BSL2 인증
분광기	젠웨이	20308	600nm에서 광학 밀도 측정
분광계 큐벳	Greiner 바이오 원	613101
스테인레스 스틸 볼 (5mm)	증권 시세	KU.5G80 1.3541
주사기 1 ml Sub-Q	BD 생명과학	305501
티슈 라이저 II	퀴아겐	85300
Transpore 저자극성 테이프	3엠	1527-1
트윈 40	시그마-알드리치	P1504-100ML
비타민 A 레티놀리 팔미타스 아이 크림	바우쉬 & 롬		Commerc. 사용 가능

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