숙주 상피 세포에 대한 박테리아 부착에서 Vitronectin의 역할을 연구하기 위한 분석

초록

출처: Singh, B. et al., 세균 접착 및 혈청 저항성에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 헤모필루스 인플루엔자가 숙주 상피 세포에 순응하는 과정에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다.

프로토콜

1. 상피 세포에 대한 박테리아의 Vn 의존적 부착에 관한 연구

1. 10%(vol/vol) 태아 송아지 혈청(FCS)(완전 배지) 및 5μg/mL 겐타마이신이 보충된 F12 배지가 있는 75cm² 조직 배양 플라스크에서 A549 세포(유형 II 폐포 상피 세포)를 배양합니다. 37°C에서 5% CO₂가 포함된 인큐베이터에서 80% 융합이 이루어질 때까지 3일 동안 플라스크를 배양합니다(포화도는 도립 현미경을 사용하여 세포의 표면 범위를 시각화하여 추정할 수 있음). 다음 4단계는 분석을 위해 상피 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.
   1. 플라스크의 세포 단층을 PBS 20mL로 부드럽게 소용돌이치며 두 번 세척합니다. 플라스크 표면에서 세포를 분리하려면 세포 분리 효소 용액 2mL를 추가하고 37°C에서 5분 동안 플라스크를 배양합니다. 손바닥으로 플라스크를 두드려 플라스틱 표면에서 모든 세포를 분리합니다. 세포 덩어리를 분산시키기 위해 피펫을 위아래로 몇 번 움직입니다.
   2. 플라스크에 F12 complete medium을 18mL 추가하고 전체 세포 현탁액을 50mL 멸균 Falcon 튜브로 옮깁니다. RT에서 200 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿을 10mL의 F12 완전 배지에 재현탁합니다.
   3. Cell suspension 10 μL를 제거하고 Eppendorf tube에 넣은 다음 Trypan blue 용액 90 μL를 추가합니다. 덮개를 놓은 후 혈구계(깊이 0.1mm)에 샘플을 로드합니다.
   4. A, B, C, D 영역(각 필드는 16개의 정사각형으로 구성되며 각 정사각형의 면적은 0.0025mm²)에서 사용 가능한 모든 셀을 계산한 다음 평균 셀 수([A+B+C+D]/4)를 계산합니다. 다음 방정식을 사용하여 밀리리터당 셀 수를 계산합니다.
      생존 세포/mL = 평균 세포 수 × 10⁴ × 희석 계수.
      메모: 여기서 희석 계수는 10입니다.
   5. 5 μg/mL 겐타마이신을 함유한 완전한 배지를 사용하여 세포 현탁액을 5.0 x 10³ cells/mL로 희석합니다. 500μL의 세포 현탁액을 24웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 세포가 90% 합류할 때까지 37°C에서 5% CO₂로 플레이트를 배양합니다.
2. 박테리아 감염 전에 웰에서 배지를 제거하고 F12 배지(FCS 제외)를 추가한 다음 37°C에서 밤새 배양합니다.
3. RT에서 500μL의 PBS로 세포 단층을 3회 세척합니다. 플레이트를 얼음 위에 놓고 10μg/mL의 Vn을 포함하는 100μL의 사전 냉각된 F12 배지를 추가합니다. 플레이트를 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 대조군 웰의 경우 F12 매체만 추가합니다.
4. 배양 후, 피펫팅으로 용액을 버리고 RT에서 1mL의 PBS로 세포층을 두 번 세척합니다.
5. 배양 Hif 임상 분리는 10μg/mL NAD와 헤민이 보충된 뇌-심장 주입(BHI) 배지와 37°C에서 200rpm에서 진탕합니다. Luria-Bertani 배지를 사용하여 E. coli를 배양하십시오. 중간 로그 단계(OD600 = 0.3)에서 Hif를 수확하고 1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.2(차단 완충액; PBS-BSA)에 의해 작성되었습니다. 현탁액을 10⁹ CFU/mL로 조정합니다. 갓 재배한 Hif M10의 배양을 F12 배지(2×10⁸ CFU/mL)에 재현탁합니다. 이 박테리아 현탁액 100μL를 각 웰에 추가하고 37°C에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   메모: 각 웰에는 약 2 x 10⁵개의 A549 셀이 포함되어 있습니다. 감염의 경우, 2 x 10⁷ 세균성 CFU가 추가되었으며, 이는 100의 감염 다수에 해당합니다.
6. 피펫팅으로 배지를 제거하고 PBS로 A549 상피 세포를 3회 세척합니다. 50 μL/well의 세포 분리 용액을 추가하고 37 °C에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다.
7. 다음으로, 웰당 50μL의 F12 완전 배지를 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 각 웰의 상피 세포(≈100 μL[즉, 전체 부피])를 4개의 유리 구슬이 들어 있는 6mL 유리관으로 옮깁니다. RT에서 2분 동안 볼텍싱하여 세포를 용해합니다.
8. 990μL의 F12 배지에 10μL의 용해물을 첨가하여 10μL의 세포 용해물을 100배 희석합니다. 희석된 시료 10μL를 초콜릿 한천 플레이트에 플레이트합니다.
9. 초콜릿 한천 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 다음 군체를 세십시오. 각 콜로니는 하나의 CFU를 나타냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브	BD 팔콘	60819-138	12 × 75mm 스타일
5% CO2 공급 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	BBD6220
6mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브	폭스바겐	89000-478	12 × 75mm 스타일 캡 포함
24웰 플레이트	BD 팔콘	08-772-1H	세포 배양 등급
75cm2 조직 배양 플라스크	BD 팔콘	BD353136	통풍
A549 세포주 인간	시그마-알드리치	86012804-1VL
세포 박리 효소(Accutase)	시그마-알드리치	A6964-500ML	세포 배양 등급
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A2058 (영어	세포 배양에 적합
F12 미디엄	시그마-알드리치	D6421	세포 배양 등급
송아지 태아 혈청(FCS)	시그마-알드리치	12003년	세포 배양에 적합
혈구계	마리엔펠트	640210
조직 배양 플라스크	BD 팔콘	3175167	75cm2
인간 혈장에서 추출한 비트로넥틴(Vn)	시그마-알드리치	V8379-50UG	세포 배양 등급

) 년 ) 개 시리즈