인간 혈청의 살균 활성에 대한 박테리아 내성에서 Vitronectin의 역할 결정

초록

출처: Singh, B. et al., 세균 접착 및 혈청 저항성에서 비트로넥틴의 역할을 연구하기 위한 분석.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 인간 혈청 당단백질인 비트로넥틴이 박테리아 저항성에 미치는 역할을 보여줍니다. 혈청의 항체는 박테리아 표면 단백질과 상호 작용하여 보체 단백질을 활성화하고 막 공격 복합체를 형성하여 박테리아 세포 용해를 일으킵니다. 박테리아 막 단백질에 대한 비트로넥틴 결합은 막 공격 복합체 형성을 방지하여 박테리아가 생존할 수 있도록 합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 인간 혈청의 살균 활성에 대한 Vn 의존성 내성 분석

1. 상업적인 출처에서 Normal Human Serum(NHS)을 구입하십시오. 비트로넥틴 또는 Vn-고갈 혈청(VDS)을 준비합니다. NHS에 존재하는 Vn에 해당하는 180nM Vn으로 VDS를 보충합니다.
2. 보체 단백질을 비활성화하기 위해 NHS를 56°C에서 30분 동안 가열하여 열 비활성화 혈청(HIS)을 준비합니다.
   메모: 분석을 위한 최적의 혈청 농도(5%) 및 배양 시간(15분)은 헤모필루스 인플루엔자 f형(Hif)에 대해 경험적으로 결정되었습니다. 이러한 매개변수는 다른 박테리아 병원체에 따라 다를 수 있습니다.
3. 배양 박테리아(이 경우 Hif M10 및 돌연변이 Hif M10Δlph)를 중간 로그 단계(OD₆₀₀ = 0.3)까지. 3,500 x g에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화합니다.
4. 2.5%(w/v) 포도당, 2mM 염화마그네슘, MgCl₂, 0.15mM 염화칼슘, CaCl₂ 및 0.1%(wt/vol) 젤라틴을 포함하는 포도당 젤라틴 베로날 완충액(DGVB⁺⁺; pH 7.3) 1부피로 박테리아 펠릿을 재현탁합니다.
5. 5% 혈청(NHS, HIS, VDS 또는 VDS+180 nM Vn)을 함유한 ^DGVB++ 100μL에 박테리아의 1.5 x 10³ 집락 형성 단위(CFU)를 추가합니다. 300rpm으로 흔들면서 37°C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
6. 0분(_T0 샘플) 및 15분(T_샘플)에서 반응 혼합물에서 10μL 분취액을 제거하고 초콜릿 한천에 플레이트합니다. 37°C에서 밤새 접시를 배양합니다.
7. 부화 후 접시에 나타나는 식민지를 세십시오. 다음 방정식을 사용하여 죽은 박테리아의 백분율을 계산합니다: (집락 형성 단위 또는 T_t에서의 CFU)/(T₀에서의 CFU) × 100.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6mL 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브	폭스바겐	89000-478	12 × 75mm 스타일 캡 포함
정상 인간 혈청(NHS)	보완 기술, Inc.	보 건국	풀드 휴먼 세럼
염화칼슘(CaCl2)	시그마-알드리치	C5670-500G
포도당	시그마-알드리치	G8270-1KG
젤라틴	시그마-알드리치	G9391	세포 배양에 적합
혈구계	마리엔펠트	640210
염화마그네슘(MgCl2)	시그마-알드리치	M8266-1KG
인간 혈장에서 추출한 비트로넥틴(Vn)	시그마-알드리치	V8379-50UG	세포 배양 등급
셰이 커	스튜어트 사이언티픽	스트R6	플랫폼 셰이커

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