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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 인간 혈청의 살균 활성에 대한 Vn 의존성 내성 분석
- 상업적인 출처에서 Normal Human Serum(NHS)을 구입하십시오. 비트로넥틴 또는 Vn-고갈 혈청(VDS)을 준비합니다. NHS에 존재하는 Vn에 해당하는 180nM Vn으로 VDS를 보충합니다.
- 보체 단백질을 비활성화하기 위해 NHS를 56°C에서 30분 동안 가열하여 열 비활성화 혈청(HIS)을 준비합니다.
메모: 분석을 위한 최적의 혈청 농도(5%) 및 배양 시간(15분)은 헤모필루스 인플루엔자 f형(Hif)에 대해 경험적으로 결정되었습니다. 이러한 매개변수는 다른 박테리아 병원체에 따라 다를 수 있습니다.
- 배양 박테리아(이 경우 Hif M10 및 돌연변이 Hif M10Δlph)를 중간 로그 단계(OD600 = 0.3)까지. 3,500 x g에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠렛화합니다.
- 2.5%(w/v) 포도당, 2mM 염화마그네슘, MgCl2, 0.15mM 염화칼슘, CaCl2 및 0.1%(wt/vol) 젤라틴을 포함하는 포도당 젤라틴 베로날 완충액(DGVB++; pH 7.3) 1부피로 박테리아 펠릿을 재현탁합니다.
- 5% 혈청(NHS, HIS, VDS 또는 VDS+180 nM Vn)을 함유한 DGVB++ 100μL에 박테리아의 1.5 x 103 집락 형성 단위(CFU)를 추가합니다. 300rpm으로 흔들면서 37°C에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
- 0분(T0 샘플) 및 15분(T샘플)에서 반응 혼합물에서 10μL 분취액을 제거하고 초콜릿 한천에 플레이트합니다. 37°C에서 밤새 접시를 배양합니다.
- 부화 후 접시에 나타나는 식민지를 세십시오. 다음 방정식을 사용하여 죽은 박테리아의 백분율을 계산합니다: (집락 형성 단위 또는 Tt에서의 CFU)/(T0에서의 CFU) × 100.