생체 외 조건에서 HIV 발병기전을 연구하기 위한 인간 자궁경부 점막 감염 모델

초록

출처: Introini, A., et al., 인간 면역결핍 바이러스 1 및 조직배양을 통한 인간 림프 조직 및 여성 생식기 점막의 생체 외 감염. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 인간 면역결핍 바이러스 1형, HIV-1에 의한 인간 자궁 점막 조직의 생체 외 감염 및 공기-액체 계면에서 젤라틴 스펀지 위에 대한 유지 관리를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 인간 조직 내에서 HIV-1 복제 및 발병 기전을 모니터링할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 자궁경부 점막의 박리 및 감염

참고: 최적의 결과를 얻으려면 자궁경부 점막 절제술을 수술 후 가능한 한 빨리, 이상적으로는 수술 당일에 처리하고 감염시켜야 합니다. 또는 검체를 4°C의 CMT(항생제가 보충된 배양 배지)에 하룻밤 동안 담가 보관하고 해부 직후 감염시킬 수 있습니다.

1. CM이 RT에 도달할 수 있는 충분한 시간을 허용하거나 37°C로 예열된 수조에 넣습니다. 사용하기 전에 CM에 항생제(CMT)를 보충하십시오. 남은 항생제 용액은 모두 버리십시오. 70% 에탄올 용액을 깨끗한 용기에 붓고 해부 절차 중 필요할 때마다 집게와 메스를 담그십시오. 도구를 청소하고 여러 기증자의 표본을 해부하는 사이에 메스 날을 교체하십시오.
2. 멸균 겸자를 사용하여 운송 용기의 샘플을 10-20mL의 CMT가 들어 있는 100mm 페트리 접시로 옮깁니다.
3. 페트리 접시의 뚜껑을 절단면으로 사용하여 조직을 해부합니다. 집게로 조직을 부드럽게 잡고 메스와 칼날로 자궁경부 및/또는 자궁경부의 점막을 기질 및 근육 아래 조직(점막하)에서 분리하여 점막 스트립을 얻습니다.
   메모: 한 조직 조각에서 작업하는 동안 조직 건조를 방지하기 위해 나머지 조직을 매체에 담그는 것이 중요합니다.
4. 점막을 2mm 너비의 스트립으로 자르고 가능한 한 많은 점막하를 제거하고 버리고 2mm 두께의 조직층만 남깁니다. 스트립을 2mm 두께의 블록으로 자릅니다. 이로 인해 약 8mm³.
   의 조직 외식이 이루어져야 합니다. 주의: 인체 표본을 해부하기 위해 날카로운 도구를 다루면 부상 및 오염의 위험이 높아집니다. 작업자는 추가 보호 장치로 금속, 메쉬 및 절단 방지 장갑 착용을 고려해야 합니다.
5. 해부를 진행하는 동안 조직 건조를 방지하기 위해 10-20mL의 CMT가 들어 있는 새로운 100mm 페트리 접시에 조직 이식을 옮깁니다. 해부가 끝나면 플레이트를 소용돌이쳐 외식 분포를 무작위화합니다.
6. 멸균 겸자를 사용하여 외식재를 멸균 1.5mL 원추형 튜브로 옮깁니다(튜브당 최대 16회 외식). 피펫을 사용하여 튜브의 매체를 제거합니다.
7. HIV-1 제제를 37°C의 수조에서 해동합니다. 필요한 경우 바이러스 스톡을 CM으로 희석합니다. 바이러스를 외식이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 잔여 바이러스 제제는 모두 폐기합니다.
   메모: 선택한 접종물이 최소 0.5mL의 부피로 함유되도록 바이러스 스톡을 희석해야 합니다(표 1). 독립적인 실험 간의 결과 변동성을 줄이려면 전체 연구에 동일한 바이러스 제제를 사용해야 합니다(재료 표).
8. 튜브를 써모 쉐이커로 옮기고 300rpm에서 37°C로 흔들면서 2시간 동안 배양합니다. 30-60분마다 튜브를 몇 번씩 부드럽게 뒤집습니다.
   참고: 효율적인 감염을 위해서는 HIV-1 제제를 해동하고 튜브를 37°C로 옮기는 데 필요한 최소 시간을 사용하는 것이 중요합니다.
9. 6웰 플레이트에 웰당 3–4mL의 멸균 인산염 완충액 식염수(PBS)를 채웁니다. HIV-1 배양 시, 피펫을 사용하여 튜브의 모든 바이러스 제제를 소독 용액이 담긴 용기에 버립니다. 겸자를 사용하여 PBS가 들어 있는 6웰 플레이트로 외식을 옮깁니다.
10. RT에서 1분 동안 외식식물을 PBS에 그대로 두었다가 PBS를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 웰에 2-3회 세척합니다. 피펫을 사용하여 PBS를 소독액이 담긴 용기에 버리십시오. 각 웰에 3-4mL의 새 PBS를 추가합니다. 두 번 더 반복하여 총 세 번 세탁합니다. 조직 건조를 방지하기 위해 외식재를 스폰지로 옮기기 직전에 PBS를 폐기하십시오.
    메모: 자궁경부 점막, 특히 자궁경부내막의 외출은 감염 중에 많은 양의 점액을 방출합니다. 가능한 한 많은 점액을 씻어내고 제거하는 것이 중요한데, 그 이유는 외식에 불특이적으로 머무르고 나중에 바이러스가 배양 상층액으로 방출되면 바이러스 복제를 가릴 수 있기 때문입니다.
11. 겸자를 사용하여 5웰 플레이트에 있는 각 젤라틴 스폰지 위에 5-8개의 외식을 12개의 접시에 옮깁니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
12. 모든 생물학적 폐기물은 위험한 생물학적 제제 취급에 관한 연구소의 규정 및 특정 위험 평가에 따라 반대쪽 용기에 폐기하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
젤폼 12-7mm 흡수성 젤라틴 스펀지	화 이자	확인국: 0009-0315-08	Gelfoam과 Spongostan은 편도선 조직과 경추 조직 모두에 대한 조직 치료에서 동등하게 잘 수행됩니다.
SPONGOSTAN 스탠다드 70 × 50 × 10 mm 흡수성 지혈 젤라틴 스폰지	Ferrosan 의료 기기	MS0002 (영문	Gelfoam과 Spongostan은 편도선 조직과 경추 조직 모두에 대한 조직 치료에서 동등하게 잘 수행됩니다.
RPMI 1640 페놀 레드 및 글루타민	써모피셔 사이언티픽	21875034	RPMI1640 MEM 비필수 아미노산, 피루브산 나트륨, 겐타마이신, 암포테리신 B 및 FBS 15%(v/v)를 추가하여 배양 배지(CM)를 만듭니다.
멸균 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4, 칼슘, 마그네슘 및 페놀 레드			수술 표본의 보관 및 운송에 사용합니다. PBS는 생리학적 pH를 가진 다른 등장성 용액으로 대체할 수 있습니다. 문화 매체는 하룻밤 보관에 가장 적합합니다.
멸균 세포 배양 등급의 물
70% 에탄올 용액
생물학적 폐기물 처리를 위한 소독제 솔루션
멸균 금속 집게 또는 핀셋
멸균 금속 가위
멸균 평면 계량 금속 주걱
멸균 메스 및 칼날
6웰 세포 배양 플레이트
멸균 페트리 접시, 100mm × 20mm
무세포 HIV-1 바이러스 제제 HIV-1BaL	NIH AIDS 시약 프로그램	510	바이러스는 여러 실험을 수행할 수 있을 만큼 충분히 큰 스톡을 생성하도록 전파되어야 합니다. 바이러스 현탁액을 분취하고 -80 °C에서 보관하십시오.동결 및 해동을 반복하지 마십시오.
무세포 HIV-1 바이러스 제제 HIV-1LAI.04	NIH AIDS 시약 프로그램	2522	바이러스는 여러 실험을 수행할 수 있을 만큼 충분히 큰 스톡을 생성하도록 전파되어야 합니다. 바이러스 현탁액을 분취하고 -80 °C에서 보관하십시오.동결 및 해동을 반복하지 마십시오.
멸균 1.5 및 2mL 스크류 캡 튜브
수조는 37 ° C로 설정
생물 안전 작업대
1.5 mL 튜브용 가열 블록이 있는 건식 수조 쉐이커, 37 °C, 300 rpm으로 설정

) 함유 제외 의 년