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1. HEK-Blue IFN-α/β 리포터 세포를 사용한 생체 활성 I형 IFN 측정.
참고: 이 세포는 HEK293 세포와 인간 STAT2 및 IRF9 유전자의 안정적인 transfection에 의해 생성되어 완전히 활성화된 type I IFN 신호 경로를 얻었습니다. 또한 IFN-α/β 유도성 ISG54 프로모터의 제어 하에 분비된 알칼리성 인산가수분해효소(SEAP) 리포터 유전자를 함유하고 있습니다. 이러한 세포를 I형 IFN으로 자극하면 JAK/STAT/ISGF3 경로가 활성화되고 SEAP의 생성이 유도됩니다.
- 10% FBS가 보충된 DMEM에서 HEK-Blue IFN-α/β 세포를 유지합니다. 바닥이 평평한 96웰 플레이트에서 웰당 50,000개 세포의 밀도로 플레이트화하고 최종 부피는 180μl입니다.
- U-bottom 96 웰 플레이트에서 웰당 220μl의 PBMC(850,000 cells/ml로 희석) 또는 220 μl의 plasmacytoid 수지상 세포(pDC)(100,000 - 500,000 cells/ml 범위의 농도)를 30 μl의 감염된 T 세포(106 cells/ml로 희석)와 혼합합니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 18-22 시간 동안 공동 배양을 배양 한 다음 V-bottom 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 400 x g에서 5분간 원심분리기
.
- 20μl의 공동 배양 상등액을 각 웰에 중복하여 첨가합니다. 또한 각 플레이트에는 일련의 내부 표준 제어(human IFNα, 100 U/ml에서 2,500 U/ml까지의 최종 농도)가 필요합니다. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO2에서 18-22 시간 동안 배양합니다.
- 효소가 존재할 때 분홍색에서 자주색/파란색으로 변하는 QUANTI-Blue 용액을 사용하여 알칼리성 인산가수분해효소 활성 수준을 측정합니다. 제조업체의 권장 사항에 따라 QUANTI-Blue를 준비합니다. 이 용액 180μl를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 또한 각 웰에 유도된 HEK-Blue IFN-α/β 세포 상층액 20μl를 추가하고 표준 IFN 제어 웰에서 색상이 발현될 때까지 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
- 620-655 nm에서 분광 광도계를 사용하여 SEAP 수준을 평가하고 IFN 표준 곡선의 선형 부분에서 외삽하여 유형 I IFN의 농도를 결정합니다.