포유류 시스템을 통한 인플루엔자 바이러스 유사 입자 생성 기술

초록

출처: Arevalo, M. T., et al.백신 접종을 위한 바이러스 유사 입자의 발현 및 정제. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 포유류 시스템에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자(VLP)의 생성을 보여줍니다. 적절한 포유류 숙주 세포에서 서로 다른 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 3개의 진핵생물 발현 벡터를 발현하면 발현된 바이러스 단백질은 숙주 원형질막에서 VLP로 자가 조립되고 세포 표면에서 발아를 통해 방출됩니다.

프로토콜

1. 인플루엔자 H3N2 VLP 생성을 위한 포유류 발현 시스템

1. 바이러스 구조 당단백질인 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다아제(NA) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV) Gag(그룹 특이적 항원) p55를 앞서 설명한 pTR600과 같은 진핵생물 발현 벡터로 서브클론합니다.
2. 화학적으로 적질된 대장균(예: DH5α)에서 DNA를 증폭하고 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 transfection 등급 플라스미드를 분리합니다. DNA의 양은 수율과 사용자의 필요에 따라 다릅니다.
3. 가습 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO₂와 함께 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 성장 배지에서 포유류 세포주 293T를 유지합니다.
4. T-150 조직 배양 플라스크에 플라스크당 45-75 x 10⁶개의 세포가 포함되도록 세포를 성장시켜 플라스크가 다음 날까지 완전한 세포 부착과 85-95%의 세포 포화도를 얻을 수 있도록 합니다. 현미경으로 세포에서 원하는 농도를 검사합니다.
   메모: 상용 transfection 시약을 사용할 때 세포 독성을 최소화하면서 최적의 단백질 발현을 얻기 위해서는 일반적으로 높은 세포 밀도가 권장되지만, 과도한 포화도는 세포 부산물을 축적하고 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다.
5. transfection 당일, 제조업체의 권장 사항에 따라 리포솜 및 DNA 혼합물을 준비하고 T-150 플라스크당 총 DNA 수량이 40μg인 HA:NA:Gag의 1:1:2 DNA 구성으로 DNA 세포를 transfection합니다. 항생제를 사용하지 않고 DNA와 리포좀 용액을 무혈청 transfection 배지에서 희석하여 각 플라스크에 총 부피가 20-30ml가 포함되도록 합니다.
   메모: 유전자 구성의 비율은 사용자 최적화가 필요할 수 있습니다. 본 명세서에서는 입증되지 않았지만, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F와 HIV Gag를 1:1 비율로 사용하여 유사한 transfection 절차가 수행되었습니다. DENV 및 CHIKV 단일 발현 플라스미드의 경우 최적의 발현을 위해 T-150 플라스크당 총 20μg의 DNA가 사용됩니다. DNA:transfection 시약 비율은 사용자에게 최적화되어 있습니다. 형질주입 방법에 따라 권장되는 형질주입 배지를 사용하며, 즉, 다양이온성 지질 형질주입은 소 태아 혈청의 감소 또는 부재를 권장하므로 혈청이 없을 때 성장을 지원하기 위해 배지에 성장 호르몬 및 미량 원소를 보충할 수 있습니다.
6. 5% CO₂ 인큐베이터를 사용하여 플라스크를 37°C로 되돌립니다. 200ml의 경우 9개의 T-150 플라스크를 사용하십시오. 세포는 VLP 수확일까지 형질주입 배양 배지에서 유지됩니다.
7. 항원에 따라 transfection 후 72-96시간 후 또는 세포 생존율이 70-80%로 감소한 경우 현미경 검사로 추정한 세포에서 배양 상등액을 수확합니다. 상층액을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 세포를 500 × g에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전시켜 세포 파편을 펠릿으로 만듭니다 .
   참고: 3일 상등액을 접착성 세포에 사전 예열된 새로운 무혈청 transfection 배지로 교체하면 수율이 비슷하거나 약간 감소한 두 번째 VLP를 얻을 수 있으므로 사용자가 최적화해야 합니다.
8. 초원심분리를 통해 침전하기 전에 0.22μm 공극 멤브레인을 통해 상층액을 풀링하고 여과합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라스미드 맥시 키트	키아겐	12163
DMEM을 참조하십시오.	셀그로	제10-013
리포펙타민	생명 기술	L3000075	리포펙타민 2000, 리포펙타민 3000
옵티-MEM I	생명 기술	31985062
Cimarec I 6 다점 교반기 플레이트	써모피셔 사이언티픽	50094596
폴리클리어 초원심분리기 튜브	세튼	7025
0.22μm 진공 필터 상단(500mL)	날진	569-0020
글리세롤	시그마	G5516

년 호 년