곤충 세포에서 Baculovirus 발현 시스템을 이용한 Chikungunya 바이러스 유사 입자 생성

초록

출처: Arevalo, M. T. et al., 백신 접종을 위한 바이러스 유사 입자의 발현 및 정제.J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 치쿤구니야 바이러스 유전자 카세트를 운반하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시켜 바이러스와 유사한 입자인 VLP가 어떻게 생성되는지 보여줍니다. 재조합 바이러스는 세포를 감염시켜 VLP를 형성, 조립 및 배양 배지로 방출하여 백신 생산에 잠재적으로 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 바큘로 바이러스/곤충 세포 시스템을 이용한 치쿤구니야 바이러스 유사 입자(VLP) 발현

1. 상용 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 S-27 균주에서 치쿤구니야 바이러스 캡시드 및 외피 단백질(C-E3-E2-6K-E1)을 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 생성합니다.
2. 28°C에서 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 사용하여 무혈청 Sf9 성장 배지에서 Spodoptera frugiperda Sf9 세포를 배양합니다.3-5 x 10⁵ c/ml를 사용하여 현탁 세포 성장을 위한 스피너 플라스크 배양을 시작합니다. 세포 밀도가 2-4 x 10⁶ c/ml(3-4일마다)의 세포 밀도에 도달하면 정기적으로 통과합니다.
3. 다점 교반기 플레이트 시스템에서 130rpm으로 교반하면서 스피너 플라스크에서 현탁액의 Sf9 세포를 배양합니다. 적절한 폭기를 위해 배양 부피를 스피너 플라스크 부피의 절반 이하로 유지하십시오.
4. Chikungunya 또는 CHIK VLP의 발현을 위해 2 x 10⁶ cells/ml의 밀도로 Sf9 세포를 1의 감염 다중도에서 재조합 baculovirus로 감염시키고 28 °C incubator로 되돌립니다. 일반적으로 250ml Sf9 세포를 포함하는 하나 또는 두 개의 스피너 플라스크를 감염시킵니다.
   메모: 이 방법을 사용하지는 않지만 Sf9 세포는 셰이커 플랫폼을 사용하여 28°C의 셰이커 플라스크에서 배양할 수 있습니다.
5. 감염 후 72-96시간 후 또는 제조업체의 프로토콜에 따라 Trypan Blue Exclusion에 의해 결정된 세포 생존율이 70-80%로 감소한 경우 배양을 수확합니다.
   메모: 세포는 감염된 동안 계속 증식하며 감염 후 3일(dpi)에 재조합 CHIK VLP 바큘로바이러스에 감염된 Sf9 배양물에서 ~80%의 생존율이 있습니다. 바큘로바이러스에 감염된 세포는 외형이 더 큽니다. 형태학은 또한 원형에서 직사각형으로 변경 될 수 있습니다. 바큘로바이러스 감염의 말기에는 세포가 용해되기 시작했습니다.
6. 현탁 배양에서 배양물을 50ml 원뿔형 튜브로 직접 옮기고 4°C에서 5분 동안 500 x g로 세포를 스핀다운합니다.
7. 초원심분리를 통해 침전하기 전에 상층액을 수집하고 0.22μm 공극 멤브레인을 통해 여과합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
옵티-MEM I	생명 기술	31985062
Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템	생명 기술	제10359-016
0.22μm 진공 필터 상단(500mL)	날진	569-0020
SF-900 II SFM	써모피셔 사이언티픽	10902-096
Cimarec I 6 다점 교반기 플레이트	써모피셔 사이언티픽	50094596