염증 마우스 모델에서 혈액 세포-내피 상호 작용을 분석하기 위한 생체 내 현미경 검사

초록

출처: Herr, N. et al., 생쥐의 장간막 정맥에서 백혈구-내피 및 혈소판-백혈구 상호 작용의 생체 내 현미경 검사. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오에서는 복강내에 지질다당류를 주입한 마우스 모델의 장간막 정맥에서 혈액 세포-내피 상호 작용의 실시간 시각화를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 취급, 염증의 준비 및 유도

1. 체중 범위가 16 - 20 g인 4 - 6 주 된 수컷 마우스를 사용하십시오. 참고 : 마우스가 더 나이가 많거나 무거우면 혈관 주변에 과도한 지방이 나타나 현미경 관찰이 제한됩니다.
2. 수술 전에 모든 도구와 현미경 테이블을 소독하십시오.
3. 현미경 검사 4시간 전에 20mg/kg LPS(지다당류)를 살아있는 마우스에 복강내 주사하여 세균성 염증을 유발합니다.
4. 0.9% 식염수를 37°C의 수조에서 예열하여 플라스틱 챔버와 장간막 조직을 가습합니다.
5. 현미경 검사 절차 직전에 케타민(100mg/kg)과 자일라진(5mg/kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 대체 마취를 사용할 수 있습니다(예: 2% 이소플루란 흡입). 반사 자극에 대한 반응 상실(강한 압력으로 발가락 또는 꼬리 꼬집음)으로 적절한 마취를 확인합니다.
6. 면도기를 사용하여 복부를 제모하고 에탄올 70 %를 적신 거즈로 느슨한 머리카락을 제거합니다.
7. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 바르십시오.

2. 수술

1. 70% 에탄올을 사용하여 복부를 살균합니다. 이 방법은 무균 방법이 아니며 실험이 끝날 때 치명적일 수 있습니다.
2. 정중 개복술 수행: 작고 구부러진 집게와 작은 가위를 사용하여 복부 피부를 엽니다. 상복부 혈관을 확인하고 혈관을 보호하기 위해 linea alba 영역의 복막을 엽니다.
3. 조직을 촉촉하게 유지하기 위해 예열된 식염수 몇 방울을 복강에 바르십시오.
4. 50μl 로다민 6G(1mg/ml)를 역궤도로 주입하여 백혈구와 혈소판을 형광으로 표시합니다.
5. 회장 고리를 외부화하고 직경 10cm의 페트리 접시에 넣으십시오. 격분으로 37°C의 예열 식염수(0.9%)를 적용하여 조직을 촉촉하게 유지하십시오.

3. 생체 내 현미경 검사

1. 마우스를 현미경 아래에 놓고 직경 200 - 300 μm의 장간막 정맥을 시야 중앙으로 가져옵니다. 주변에 지방이 보이지 않는 용기를 선택하십시오.
2. 장간막 혈관을 만지지 않도록 하여 내피의 자극을 피하십시오. 회장 고리를 조심스럽게 다루십시오.
3. 현미경 소프트웨어를 사용하여 도립 또는 정립 현미경과 카메라로 혈액 세포-내피 상호 작용을 시각화합니다. 마우스당 4개의 서로 다른 정맥에서 1분 동안 혈액 세포-내피 상호 작용을 기록합니다.
4. 이미징 실험 완료 후 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.

4. 분석

1. 모든 매개변수에 대해 오프라인으로 및 블라인드 분석을 수행합니다. 적절한 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석을 수행합니다.
2. 루미날 내 혈구 흐름에 초점을 맞춘 고시간 해상도 cine-clip(최대 프레임 속도)에서 안정적이고 개인 간 비교 가능한 혈류 조건을 확인합니다.
3. 롤링 백혈구의 수를 정량화합니다. 따라서 정맥을 통해 수직선을 그리고 1분 안에 이 선을 넘는 모든 백혈구를 세십시오.
4. 단일 백혈구 하나가 내피에서 안정적으로 굴러가면서 50μm의 거리를 통과하는 데 필요한 시간을 측정하여 롤링 속도를 결정합니다. 이렇게하려면 정맥을 통해 50μm 거리에 두 개의 수직선을 그립니다.
   1. 대표적인 백혈구가 한 라인에서 다른 라인으로 이동하는 데 필요한 시간을 측정합니다. 50μm를 필요한 시간(μm/s)으로 나누어 백혈구의 속도를 계산합니다.
5. 0.04 mm의 필드에서 백혈구 접착력을 측정합니다². 이렇게하려면 한 변 길이가 200μm 인 사각형을 정맥에 그립니다.
   1. 이 사각형 내에서 30초 동안 눈에 보이는 움직임이 없는 것으로 정의되는 단단히 부착된 백혈구를 세십시오.
6. 혈소판-백혈구 상호 작용을 정량화하기 위해 하나의 백혈구에 결합된 혈소판의 수를 계산합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
로다 민 6G	시그마-알드리치	989-38-8
대장균에서 지방다당류 055:B5	시그마-알드리치	L2637