동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 피하주사를 위한 항원제제
- Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra 분말의 흡입 또는 피부 접촉을 방지하기 위해 화학 흄 후드 내부에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. Complete Freund's Adjuvant(일반적으로 BSL-1)에 대한 기관 정책에 따라 처리합니다. 여기에는 내화학성 장갑, 보안경, 보호용 작업복(실험복) 사용이 포함됩니다.
- 실험 동물에 도입될 시약의 오염을 방지하기 위해 우수한 멸균 기술을 사용하십시오.
- 5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 동결건조된 열사(heat-killer-killed) Mycobacterium tuberculosis H37Ra 분말 5mg과 차가운 PBS 2.5mL를 혼합하여 인산염 완충 식염수(PBS)에 Mtb 현탁액을 만듭니다. 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다.
- PBS에서 H37Ra의 미세한 현탁액을 생성하려면 얼음 위에서 5분 동안 현탁액을 초음파 처리합니다.
- 언클amp 컨버터 장치 본체를 만들고 70%(v/v) 알코올 면봉으로 프로브를 청소합니다.
- 초음파 처리기를 켜고 전원 조절 손잡이를 돌려 전원 설정을 4로 조정한 다음 프로브 팁을 PBS 함유 마이코박테리아 분말에 담그십시오. 프로브 팁이 샘플 깊이의 절반 이상까지 잠겨 있고 프로브 팁이 마이크로 원심분리기 튜브의 벽에 닿지 않는지 확인하십시오.
- 혼합물을 얼음에서 30초 동안 초음파 처리하고 30초 동안 일시 중지한 다음 총 5분 동안 반복하여 액체를 가열하지 않고 분말을 균일한 현탁액으로 완전히 분산시킵니다.
- 혼합물에 Freund's Incomplete Adjuvant 2.5mL를 첨가하고 에멀젼이 치약과 같은 농도를 형성할 때까지 얼음에서 초음파 처리 과정을 반복합니다.
- 컨트롤 노브를 사용하여 전원을 0으로 설정하고 장치를 끄면 초음파 처리가 종료됩니다. 현탁액에서 팁을 제거하고 알코올 면봉으로 프로브를 닦습니다.
- 항원 에멀젼을 4°C에서 보관하십시오. 에멀젼을 배치하면 실험 전반에 걸쳐 일관성을 보장하는 데 도움이 됩니다. 에멀젼은 최대 3개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 피하 주사
- 유리체강내 주사 일주일 전(-7일로 지정됨)에 피하 주사를 수행합니다.
- 1mL 주사기(바늘이 부착되지 않음)에 마이코박테리아 에멀젼을 로드합니다. 에멀젼의 점도와 불투명도로 인해 보기 어려운 기포가 주사기를 채울 수 있습니다.
- 주사기에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 0.2-0.3mL의 에멀젼을 넣은 후 주사기를 뒤집고(끝이 위를 향함) 카운터 가장자리에 주사기를 반복해서 가볍게 두드려 기포를 표면으로 가져옵니다.
- 주사기에서 공기를 배출하고 주사기를 계속 채웁니다. 뒤집고 채워질 때까지 간헐적으로 누릅니다.
- 주사기에 25g의 바늘을 놓고 에멀젼을 전진시켜 바늘을 채웁니다. 사용할 때까지 주사기를 얼음 위에 보관하십시오.
- 피하 주사를 안전하게 수행하려면 마우스를 마취하거나 동물의 뒷다리에 쉽게 접근할 수 있는 인도적 구속 방법을 활용하십시오.
- 피하 주사를 위해 마취하려면 동물을 이소플루란 유도실(유도의 경우 3%-4%, 유지의 경우 1%-3%)에 넣습니다. 마취가 끝나면 마우스의 호흡 속도가 느리고 호흡 곤란의 징후가 없는지 확인하십시오.
- 엉덩이의 등쪽 표면이나 서혜부 림프절 부위에 가까운 다리의 복부 표면에 피하 주사를 놓습니다.
- 근육에 주입되지 않도록 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. Mtb 에멀젼 0.05mL를 피하 공간에 주입합니다. 두꺼운 에멀젼이 완전히 주입될 수 있도록 바늘을 즉시 제거하지 마십시오.
- 동물당 총 0.1mL까지 왼쪽과 오른쪽 모두에 주사를 반복합니다.
- 마취된 경우 완전히 회복될 때까지 마우스를 따뜻한 발열 패드에 올려 놓습니다. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
- 완전히 회복되면 마우스를 케이지로 되돌리고 케이지 카드에 피하 주사 날짜를 표시합니다.
- 경구용 아세트아미노펜(200mg/kg/일)으로 진통제를 제공하되 항염증제가 포도막염 유발에 영향을 줄 수 있으므로 비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 제공하지 마십시오.