감염 후 포도막염을 연구하기 위한 프라이밍 마이코박테리아 포도막염의 쥐 모델

초록

출처: John, S., et al. 감염 후 포도막염의 모델로서의 프라이밍된 마이코세균성 포도막염(PMU). J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 감염 후 포도막염을 연구하기 위해 프라임된 마이코세균성 포도막염(PMU)의 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이전에 동일한 면역원으로 면역된 마우스에서 열에 의해 사멸된 결핵균의 유리체강내 주사에 의한 PMU를 유도한 후, 이미징 및 조직병리학적 검사를 사용하여 눈의 만성 염증의 진행을 분석합니다

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 피하주사를 위한 항원제제

1. Mycobacterium tuberculosis(Mtb) H37Ra 분말의 흡입 또는 피부 접촉을 방지하기 위해 화학 흄 후드 내부에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오. Complete Freund's Adjuvant(일반적으로 BSL-1)에 대한 기관 정책에 따라 처리합니다. 여기에는 내화학성 장갑, 보안경, 보호용 작업복(실험복) 사용이 포함됩니다.
2. 실험 동물에 도입될 시약의 오염을 방지하기 위해 우수한 멸균 기술을 사용하십시오.
3. 5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 동결건조된 열 사멸 Mtb H37Ra 분말 5mg과 차가운 PBS 2.5mL를 혼합하여 인산염 완충 식염수(PBS)에서 Mtb 현탁액을 만듭니다. 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다.
4. PBS에서 H37Ra의 미세한 현탁액을 생성하려면 얼음 위에서 5분 동안 현탁액을 초음파 처리합니다.
   1. 언클amp 컨버터 장치 본체를 만들고 70%(v/v) 알코올 면봉으로 프로브를 청소합니다.
   2. 초음파 처리기를 켜고 전원 조절 손잡이를 돌려 전원 설정을 4로 조정한 다음 프로브 팁을 PBS 함유 마이코박테리아 분말에 담그십시오. 프로브 팁이 샘플 깊이의 절반 이상까지 잠겨 있고 프로브 팁이 마이크로 원심분리기 튜브의 벽에 닿지 않는지 확인하십시오.
5. 혼합물을 얼음에서 30초 동안 초음파 처리하고 30초 동안 일시 중지한 다음 총 5분 동안 반복하여 액체를 가열하지 않고 분말을 균일한 현탁액으로 완전히 분산시킵니다.
6. 혼합물에 Freund's Incomplete Adjuvant 2.5mL를 첨가하고 에멀젼이 치약과 같은 농도를 형성할 때까지 얼음에서 초음파 처리 과정을 반복합니다.
7. 컨트롤 노브를 사용하여 전원을 0으로 설정하고 장치를 끄면 초음파 처리가 종료됩니다. 현탁액에서 팁을 제거하고 알코올 면봉으로 프로브를 닦습니다.
8. 항원 에멀젼을 4°C에서 보관하십시오. 에멀젼을 배치하면 실험 전반에 걸쳐 일관성을 보장하는 데 도움이 됩니다. 에멀젼은 최대 3개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 피하 주사

1. 유리체강내(IVT) 주사 일주일 전(-7일로 지정됨)에 피하 주사를 수행합니다.
2. 1mL 주사기(바늘이 부착되지 않음)에 마이코박테리아 에멀젼을 로드합니다. 에멀젼의 점도와 불투명도로 인해 보기 어려운 기포가 주사기를 채울 수 있습니다.
   1. 주사기에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 0.2-0.3mL의 에멀젼을 넣은 후 주사기를 뒤집고(끝이 위를 향함) 카운터 가장자리에 주사기를 반복해서 가볍게 두드려 기포를 표면으로 가져옵니다.
3. 주사기에서 공기를 배출하고 주사기를 계속 채웁니다. 뒤집고 채워질 때까지 간헐적으로 누릅니다.
4. 주사기에 25g의 바늘을 놓고 에멀젼을 전진시켜 바늘을 채웁니다. 사용할 때까지 주사기를 얼음 위에 보관하십시오.
5. 피하 주사를 안전하게 수행하려면 마우스를 마취하거나 동물의 뒷다리에 쉽게 접근할 수 있는 인도적 구속 방법을 활용하십시오.
6. 피하 주사를 위해 마취하려면 동물을 이소플루란 유도실(유도의 경우 3%-4%, 유지의 경우 1%-3%)에 넣습니다. 마취가 끝나면 마우스의 호흡 속도가 느리고 호흡 곤란의 징후가 없는지 확인하십시오.
7. 엉덩이의 등쪽 표면이나 서혜부 림프절 부위에 가까운 다리의 복부 표면에 피하 주사를 놓습니다.
   1. 근육에 주입되지 않도록 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오. Mtb 에멀젼 0.05mL를 피하 공간에 주입합니다. 두꺼운 에멀젼이 완전히 주입될 수 있도록 바늘을 즉시 제거하지 마십시오.
   2. 동물당 총 0.1mL까지 왼쪽과 오른쪽 모두에 주사를 반복합니다.
8. 마취된 경우 완전히 회복될 때까지 마우스를 따뜻한 발열 패드에 올려 놓습니다. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
9. 완전히 회복되면 마우스를 케이지로 되돌리고 케이지 카드에 피하 주사 날짜를 표시합니다.
10. 경구용 아세트아미노펜(200mg/kg/일)으로 진통제를 제공하되, 항염증제가 포도막염 유발에 영향을 줄 수 있으므로 비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 제공하지 마십시오.

3. 유리체강내 주사를 위한 항원 원료 준비

1. 유리체강내 Mtb 현탁액의 오염을 방지하기 위해 적절한 멸균 조건에서 이 섹션의 모든 절차를 수행합니다.
2. 유리체강내 현탁액을 만듭니다.
   1. 경증에서 중등도의 범포도막염을 유도하려면 1x PBS 1mL에 마이코박테리아 추출물 5mg을 첨가하여 유리체강내 현탁액을 5mg/mL 농도로 만듭니다.
   2. 중등도에서 중증의 범포도막염을 유발하려면 1x PBS 1mL에 마이코박테리아 추출물 10mg을 첨가하여 10mg/mL 농도로 유리체강내 현탁액을 만듭니다.
3. 30초 동안 한 번 소용돌이친 다음 얼음 위에 놓습니다.
4. PBS에서 H37Ra의 미세한 현탁액을 생성하려면 1.4단계에서 설명한 대로 얼음 위에서 10분 동안 현탁액을 초음파 처리합니다. 이 원액을 100μL 부피로 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
5. 사용하기 전에 실온에서 해동하고 1분 동안 높은 온도에서 소용돌이치십시오. 부분 표본을 동물 시설로 운반하는 동안 얼음 위에 보관하십시오.

4. 0일차 유리체강내 주사 절차

1. 동물 준비
   1. 꼭 맞는 검사 장갑을 착용하고 마우스를 저울에 올려 놓고 무게를 그램 단위로 구합니다.
   2. 100mg/mL 케타민과 20mg/mL의 자일라진을 멸균수와 혼합한 용액을 체중 0.02mL/g의 복강내 주사하여 동물을 마취합니다. 대안적인 접근법으로는 ~1.5% 이소플루란(흡입)을 사용한 유도가 있습니다.
   3. 마우스가 잠들 때까지 약 2분 정도 기다린 다음 마우스를 보온 상자에 넣고 뚜껑을 덮습니다. 귀, 발가락, 꼬리 꼬집기와 같은 통증 반사 검사를 수행하여 시술에 대한 마취 깊이를 평가합니다.
   4. 잠이 들면 0.5%(v/v) 테트라카인 1방울로 각막을 마취합니다. 테트라카인을 쥐의 코나 입 근처에 두지 마십시오. 10초 후 여분의 액체를 톡톡 두드려 제거합니다.
      메모: 국소 마취를 시행할 때 홍채 확장 및 전방(AC) 시각화가 개선되는 것이 관찰되었는데, 이는 전신 마취와 국소 마취를 결합하여 각막 반사 억제가 개선되었기 때문일 수 있습니다. 그러나 원하는 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다.
   5. 2.5%(v/v) 페닐에프린을 1방울 떨어뜨려 동공을 확장시킵니다. 코나 입으로 들어갈 수 있는 과도한 비말이 나오지 않도록 주의하십시오. 2-3분 후 여분의 액체를 가볍게 두드리십시오.
   6. 안구내염의 위험을 줄이려면 5% 베타딘 1방울을 눈 표면과 주변 모발에 떨어뜨립니다. 2-3분 동안 눈에 두십시오.
      메모: 안구내염을 예방하기 위해 적절한 멸균 상태에서 이 섹션의 모든 절차를 수행하십시오.
   7. 베타딘을 제거하고 하이프로멜로스(0.3%) 또는 카보머 아이 젤 0.2% w/w)로 눈을 덮어 마취 하의 건조함을 방지합니다. 이것은 또한 백내장 형성을 예방하는 데 도움이 됩니다.
2. 미세주입 시스템 설정
   1. 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러와 주사기 주사기에 연결된 마이크로 펌프를 사용하여 유리체강 주입을 수행합니다(그림 1A-C). 또는 하위 섹션 4.4에 설명된 대로 Hamilton 주사기에 부착된 33G 바늘로 주입합니다.
   2. 주입 홀더에 34G 바늘을 연결하여 주입기를 조립합니다. 주입 홀더의 앞쪽 끝에 있는 은색 나사 캡을 풀고 바늘을 홀더 본체에 절반 정도 밀어 넣습니다. 은색 나사 캡을 손가락으로 단단히 조입니다.
   3. 4.2.4-4.2.5단계에서 언급한 대로 튜브를 사출 홀더에 연결합니다.
   4. 주입 홀더에 튜브를 삽입하려면 홀더 뒤쪽 끝에 있는 플라스틱 나사를 풀고 내부 개스킷을 통해 튜브를 밀어 넣은 다음 나사를 조입니다.
   5. 주입 중 튜브 손상을 방지하기 위해 튜브 끝과 약간의 간격을 유지하십시오. 그림 1C를 참조하십시오.
   6. mycobacterium 스톡 현탁액의 100μL 분취액을 해동합니다.
   7. 3μL의 1% 플루오레세인 나트륨(AK-Fluor) 용액을 넣고 잘 와류를 만듭니다.
   8. 10μL 주사기에 기포를 포함하지 않고 항원과 플루오레세인 혼합물을 로드합니다.
   9. 주사기에서 로딩 바늘을 제거하고 팁이 주사기 본체의 0 표시에 도달할 때까지 은색 나사 캡 개스킷을 통해 튜브를 밀어 넣습니다.
   10. 튜브의 끝이 원하는 위치에 올바르게 정렬되면 나사 캡을 손가락으로 단단히 조입니다.
   11. 주입 튜브를 통해 주사기의 용액을 세척하여 시스템을 완전히 로드합니다. 그런 다음 4.2.8-4.2.11단계를 반복하여 주입을 위해 주사기를 다시 로드합니다.
   12. 로드된 주사기를 마이크로 펌프에 설치하려면 cl을 누르십시오.amp 마이크로 펌프 끝에 있는 해제 버튼을 눌러 주사기 cl을 엽니다.amps.
   13. 플런저의 캡을 마이크로 펌프의 뒤쪽 끝에 있는 플런저 캡 홀더에 놓습니다.
   14. 그런 다음 주사기 칼라를 칼라 스톱에 밀어 넣고 주사기 본체를 주사기 클램프에 밀어 넣습니다.
   15. CL을 해제amp 버튼을 누르고 플런저 고정 나사를 조입니다. 그림 1D를 참조하십시오.
   16. 주입 홀더와 바늘을 o-cl을 통해 밀어 넣습니다.amp 정위 주입 장치의 . 이것은 사용자 정의 플랫폼입니다. 또는 주사기를 수동으로 잡고 배치할 수 있습니다.
   17. 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러에서 주입량과 주입량의 속도를 설정하여 각각 40nL/s의 속도로 사이클당 500nL를 주입합니다.
       메모: 더 빠른 주입 속도를 사용할 수 있지만 바늘 재배치를 달성하기 전에 더 많은 역류가 발생할 수 있습니다.
   18. 유리체강내 주사를 수행하기 전에 시스템이 올바르게 작동하는지 테스트하십시오.
       메모: 분사 시스템이 올바르게 작동할 때 풋 페달이나 제어 패드를 사용하여 주입 주기를 활성화하면 플런저 캡 홀더가 눈에 띄게 움직이고 바늘 끝에 녹색 액체의 작은 방울이 보입니다. 액체가 생성되지 않는 경우 추가 사이클을 활성화하거나 주사기를 세척하고 다시 로드하십시오.
   19. 눈에 주사하기 전에 95% 에탄올 패드로 바늘을 부드럽게 닦습니다.
3. 유리체강내 주사 절차
   1. 마우스는 주입 절차를 수행하기 위해 입체 장치에 배치됩니다.
   2. 마우스가 놓여 있는 스테이지/플랫폼을 표면에 2-3개의 종이 타월을 부착하여 따뜻하게 유지하십시오.
   3. 플랫폼에 엎드린 위치에 마우스를 놓습니다. 오른쪽 및 왼쪽 이어바를 사용하여 동물의 머리를 부드럽게 고정합니다. 그림 1E를 참조하십시오.
   4. 마우스를 배치하고 오른쪽 눈의 위쪽 코 부분이 보이도록 스코프 아래의 방향을 지정합니다.
   5. 30G 바늘을 사용하여 속눈썹을 제거하고 공막을 노출시킵니다. 변연계와 요골 혈관을 시각화합니다.
   6. 멸균 30G 바늘을 사용하여 윤부 뒤쪽 1-2mm 공막에 가이드 구멍을 만듭니다.
   7. 주사 홀더에 부착된 34G 바늘을 가이드 구멍을 통해 렌즈를 피할 수 있는 각도로 눈에 삽입하되 바늘 끝을 유리강에 삽입합니다.
   8. 마이크로 시린지 펌프 컨트롤러를 사용하여 Mtb 추출물 1μL를 유리강에 조심스럽게 주입합니다. 지속적인 역류의 경우 적절한 투여 전달을 보장하기 위해 주입량을 1.5μL로 늘리십시오.
      메모: 가짜 대조군의 경우, 1μL의 PBS를 동물의 눈에 주입합니다.
   9. 눈의 녹색 반사를 시각화하여 유리체강내 배치를 확인합니다. 그림 1F를 참조하십시오.
   10. 10초 후 눈에서 바늘을 빼냅니다. 역류에 유의하십시오.
   11. 플랫폼에서 마우스를 제거하고 각막 보호를 위해 양쪽 눈에 0.3% 하이프로멜로스 또는 0.2% w/w 카보머 아이 연고를 바르고 회복 보온 상자로 이동합니다.
   12. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌아가지 마십시오.
   13. 마우스가 완전히 깨어나면 케이지로 돌아가 아세트아미노펜(200-300mg/kg/일) 약용 물병을 추가합니다. 케이지 카드에 IVT 주사 날짜를 표시합니다.
   14. 유리체강내 주사는 일반적으로 내약성이 우수합니다. 통증과 연구에서 제외해야 할 필요성을 나타낼 수 있는 임상 징후에는 안구 주위 탈모증(자가 외상을 암시함), 각막 궤양, 체중 감소 및 구부정한 자세가 포함됩니다.

결과

그림 1: 마우스 유리체강내 주입 설정. 유리체강내 주사는 (A) (B) 마이크로 펌프에 연결된 마이크로 주사기 펌프 컨트롤러 및 (C) 주사 주사기를 사용하여 마우스 눈에 수행됩니다. 주사기가 로드되어 (D) 마이크로 펌프에 장착됩니다. 마우스 헤드는 유리체강내 주입 절차 중 안정성과 일관성을 보장하기 위해 (E) 이어바를 사용하여 배치됩니다. (F) 주사 용액의 플루오레세인은 성공적인 시술 후 눈 내부에서 녹색 반사를 생성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AK-플루오르	Akorn Pharmaceuticals, 미국 일리노이주		10% 플루오레세인 나트륨 100mg/mL, 5mL 바이알
아나세드	Akorn Animal Health, 미국 일리노이주	재질 보기 NDC 59399-110-20	자일라진 20mg/mL
Betadine 5% 멸균 안과 준비 솔루션	알콘, 텍사스, 미국	8007-1
B-D 정밀 글라이드 바늘 -25g	Becton, Dickinson and Company, 뉴저지, 미국	305122
B-D 정밀 글라이드 바늘 -30-G	Becton, Dickinson and Company, 뉴저지, 미국	305106
본드 MAX, 본드 Rx	라이카 바이오시스템즈, 일리노이, 미국		자동 IHC 염색 시스템
클로람페니콜 연고	Martindale Pharma, 영국 롬포드		1% w/w 클로람페니콜
EG1150H	라이카 바이오시스템즈, 일리노이, 미국		조직 임베딩
엔비수 R2300	바이오프티젠/라이카		OCT 머신
프로인트의 불완전 보조제	BD Difco, 뉴저지, 미국	263910
GenTeal 윤활제 눈 연고	알콘, 텍사스, 미국	---
GenTeal 윤활제 아이 젤	알콘, 텍사스, 미국	---
H37Ra 동결건조된 마이코박테리아 추출물	BD Difco, 뉴저지, 미국	231141
해밀턴 RN 니들 (33/12/2)S	해밀턴, 리노, 네바다	7803-05(33/12/2)	33 지
해밀턴 시린지	해밀턴, 리노, 네바다	CAL7633-01	5 μL
인슐린 주사 바늘	Exel International, 미국	26029	1 mL
이소플루란
케타셋	Zoetis, 미국	377341	케타민 HCL 100 mg/mL
마이크로사출 주사기 펌프 및 Micro4Controller	World Precision Instruments, 플로리다, 미국	UMP3
미크론 IV	피닉스 연구소, 플레즌튼, 캘리포니아		대체 이미징/OCT 기계
나노필 10μL 주사기	World Precision Instruments, 플로리다, 미국	(주)나노필
Nanofil 인공 주사 키트	World Precision Instruments, 플로리다, 미국	IO-키트
올림푸스 SZX10	올림푸스		해부 범위
PBS (PBS)	지브코	14190
페닐에프린 염산염 안과 용액 USP 2.5% 멸균 15mL	Akorn Pharmaceuticals, 미국 일리노이주	17478020115
RM2255 링깃	라이카 바이오시스템즈, 일리노이, 미국		조직 절편
TB 주사기	Becton, Dickinson and Company, 뉴저지, 미국	309602	1 mL
테트라카인 0.5%	알콘, 텍사스, 미국	1041544
Tissue Tek VIP 시리즈	사쿠라 파인텍 USA, Inc., CA.		조직학 조직 처리
트로피카미드 1%	Chauvin Pharmaceuticals, 영국 롬포드		최소
타이레놀	Johnson & Johnson Consumer Inc, 펜실베니아, 미국	재질 보기 NDC 50580-614-01	아세트아미노펜
점성	Novartis Pharmaceuticals, 영국 캠벌리		카보머 아이 젤 0.2% w/w