감염을 위한 Mycobacterium bovis BCG lux 접종물의 준비 및 정량화

초록

출처: Asai, M. et al., Mycobacterium tuberculosis 복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추 동물 Galleria melonella의 사용. J. Vis. 특급 (2019)

이 동영상은 생물 발광 분석 및 집락 형성 단위 열거를 사용하여 Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux 접종물의 준비 및 정량화를 보여줍니다. 준비된 접종물은 감염 연구에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 아래에 설명된 모든 작업은 현지 건강 및 안전 지침에 따라 클래스 2 미생물 안전 캐비닛(MSC) 내의 CL2 실험실에서 수행해야 합니다.

1. 감염에 대한 M. bovis BCG lux의 준비

1. 루시페라제 효소를 암호화하는 Vibrio harveyi의 luxAB 유전자를 운반하는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 형질전환된 몬트리올 백신 균주인 M. bovis BCG lux의 냉동 1.2mL 글리세롤(15%) 스톡을 해동합니다.
2. 라벨이 부착된 250mL 삼각 플라스크에 0.2% 글리세롤, 10% 알부민, 포도당, 카탈라아제(ADC) 농축 및 50μg/mL 하이그로마이신이 함유된 Middlebrook 7H9 육수 15mL에 해동된 1.2mL의 BCG 럭스 분취
액을 접종합니다.
3. 플라스크를 밀봉된 생물 안전 용기에 넣고 37°C의 오비탈 셰이커 인큐베이터에서 220rpm으로 72시간 동안(또는 배양이 성장의 중간 로그 단계에 도달할 때까지) 배양합니다.
4. 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, 0.01M 인산염 완충액, 0.0027M 염화칼륨, 0.137M 염화나트륨)를 복제하여 발광계 튜브에서 배양액을 1:10 희석하여 BCG lux 배양의 성장을 확인합니다. 볼류를 일으키고 광도계 튜브를 광도계에 로드하고 n-데실 알데히드를 기판으로 사용하여 생물 발광(상대 조명 단위[RLU]/mL)을 측정합니다(절대 에탄올의 경우 1% v/v).
   메모: RLU/집락 형성 단위(CFU)의 비율은 이전에 BCG lux가 Middlebrook 7H9 육수에서 체외에서 성장할 때 3:1로 결정되었습니다.
5. 실온에서 10분 동안 2,175 x g의 배양액을 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상등액을 마이코박테살라이즌 활성이 알려진 적절한 소독제에 버립니다. 모든 배양 폐기물은 현지 지침에 따라 마이코박테리아에 적합한 소독제로 처리하십시오.
6. 박테리아 응집을 방지하기 위해 0.05% 폴리소르베이트 80(PBS-T)이 함유된 PBS에서 세포 펠릿을 두 번 세척합니다.
7. 최종 세척 후, 디캔트 폐기물 상층액을 투여하고, Mycobacterial 세포 펠릿을 PBS-T에 재현탁시키고, RLU 측정을 사용하여 Mycobacterial 현탁액을 원하는 세포 밀도로 희석합니다.
8. PBS-T를 사용하여 24웰 플레이트에 접종물의 10배 연속 희석액을 준비합니다. Middlebrook 7H11 한천 플레이트(0.5% 글리세롤, 50μg/mL 하이그로마이신, 10% 올레산, 알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제[OADC])에 10μL를 복제하여 접종물 CFU 수를 열거합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5ml 반응 튜브(Eppendorf)	에펜도르프	22431021
20, 200 및 1000 μl 피펫 및 여과된 팁	모든 공급업체	해당 없음
24웰 배양 플레이트	그라이너	662160
25ml 피펫 및 피펫 보이	모든 공급업체	해당 없음
3칸 페트리 접시(94/15mm)	그라이너	637102
원심 분리기	모든 공급업체	해당 없음
클래스 II 안전 캐비닛	모든 공급업체	해당 없음
에탄올 (>99.7%)	폭스바겐	제208221.321
글리세롤	시그마-알드리치	G5150
하이그로마이신 B	코 닝	30-240크롬
광도계(Autolumat LB 953)	베르톨트	34622
광도계 튜브	코 닝	352054
마이크로 원심분리기	모든 공급업체	해당 없음
미들브룩 7H11 한천	BD 생명과학	283810
미들브룩 7H9 육수	BD 생명과학	271310
Middlebrook ADC 농축	BD 생명과학	212352
Middlebrook OADC 농축	BD 생명과학	212240
마이코박테리움 보비스 BCG 럭스	다양한	해당 없음
N-데실 알데히드	시그마-알드리치	D7384-100G
오비탈 쉐이킹 인큐베이터	모든 공급업체	해당 없음
인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	P4417-100탭
폴리소르베이트 80 (트윈-80)	시그마-알드리치	P8074-500ml
벤트 캡이 있는 삼각 플라스크(250ml)	코 닝	CLS40183
윈텀(V1.08)	베르톨트	해당 없음	프로그램 LB953.TTB