곤충 유충에서 세균 감염 모델을 확립하는 기술

초록

출처: Asai, M., et al. Mycobacterium tuberculosis 복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추 동물 Galleria melonella의 사용. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 큰밀랍나방인 Galleria mellonella의 유충에서 Mycobacterium bovis 감염 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. Mycobacterium bovis BCG의 생물 발광 균주를 유충의 혈림프에 주입하여 감염을 확립하고, 감염 진행 상황을 연구하기 위해 미리 정의된 간격으로 생물 발광을 측정합니다.

프로토콜

참고: 아래에 설명된 모든 작업은 현지 건강 및 안전 지침에 따라 클래스 2 미생물 안전 캐비닛(MSC) 내의 CL2 실험실에서 수행해야 합니다.

1. 감염에 대한 M. bovis BCG lux의 준비

1. 루시페라제 효소를 암호화하는 Vibrio harveyi의 luxAB 유전자를 운반하는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 형질전환된 몬트리올 백신 균주인 M. bovis BCG lux의 냉동 1.2mL 글리세롤(15%) 스톡을 해동합니다.
2. 라벨이 부착된 250mL 삼각 플라스크에 0.2% 글리세롤, 10% 알부민, 포도당, 카탈라아제(ADC) 농축 및 50μg/mL 하이그로마이신이 함유된 Middlebrook 7H9 육수 15mL에 해동된 1.2mL의 BCG 럭스 분취
액을 접종합니다.
3. 플라스크를 밀봉된 생물 안전 용기에 넣고 37°C의 오비탈 셰이커 인큐베이터에서 220rpm으로 72시간 동안(또는 배양이 성장의 중간 로그 단계에 도달할 때까지) 배양합니다.
4. 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4, 0.01M 인산염 완충액, 0.0027M 염화칼륨, 0.137M 염화나트륨)를 복제하여 발광계 튜브에서 배양액을 1:10 희석하여 BCG lux 배양의 성장을 확인합니다. 볼류를 일으키고 광도계 튜브를 광도계에 로드하고 n-데실 알데히드를 기판으로 사용하여 생물 발광(상대 조명 단위[RLU]/mL)을 측정합니다(절대 에탄올의 경우 1% v/v).
   메모: RLU/집락 형성 단위(CFU)의 비율은 이전에 BCG lux가 Middlebrook 7H9 육수에서 체외에서 성장할 때 3:1로 결정되었습니다.
5. 실온에서 10분 동안 2,175 x g의 배양액을 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상등액을 마이코박테살라이즌 활성이 알려진 적절한 소독제에 버립니다. 모든 배양 폐기물은 현지 지침에 따라 마이코박테리아에 적합한 소독제로 처리하십시오.
6. 박테리아 응집을 방지하기 위해 0.05% 폴리소르베이트 80(PBS-T)이 함유된 PBS에서 세포 펠릿을 두 번 세척합니다.
7. 최종 세척 후, 디캔트 폐기물 상층액을 투여하고, Mycobacterial 세포 펠릿을 PBS-T에 재현탁시키고, RLU 측정을 사용하여 Mycobacterial 현탁액을 원하는 세포 밀도로 희석합니다.
8. PBS-T를 사용하여 24웰 플레이트에 접종물의 10배 연속 희석액을 준비합니다. Middlebrook 7H11 한천 플레이트(0.5% 글리세롤, 50μg/mL 하이그로마이신, 10% 올레산, 알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제[OADC])에 10μL를 복제하여 접종물 CFU 수를 열거합니다.

2. G. mellonella 유충의 준비

1. 적절한 출처에서 마지막 instar 유충을 구입하고 도착 시 18°C의 어둠 속에서 유충을 유지하고 구입 후 1주일 이내에 사용하십시오. 또는 유충은 Jojāo et al의 프로토콜에 따라 스스로 사육할 수 있습니다. 구입한 유충의 경우 보관하기 전에 죽거나 변색되거나 번데기가 된 유충을 버리십시오.
   메모: 번데기 유충은 형태학적으로 마지막 instar 유충과 구별할 수 있습니다.
2. 변색이 거의 또는 전혀 없는 균일한 크림 색상(멜란화), 크기(길이 2-3cm), 무게(약 250mg), 높은 수준의 운동성을 나타내고 뒤집었을 때 스스로를 바로잡을 수 있는 능력을 가지고 있는 실험을 위해 건강한 유충을 식별하고 선택합니다.
3. 오염을 최소화하기 위해 뭉툭한 끝 핀셋을 사용하여 여과지(94/15mm)가 늘어선 페트리 접시(94/15mm)에 건강한 유충(그룹당 최소 20-30마리)을 조심스럽게 세고 사용할 때까지 어두운 실온에서 보관하십시오.

3. G. mellonella를 BCG lux로 감염

1. MSC 내의 혼란을 최소화하여 오염 및 주삿바늘 찔림 부상의 위험을 줄입니다.
2. 원형 여과지(94mm)를 평평하고 융기된 표면에 테이프로 붙여서 사출 플랫폼을 준비합니다. 부드럽거나 단단한 표면을 사용할 수 있으며 예를 들어 피펫 상자 뚜껑 또는 나일론 수세미와 같은 사용자 선호도에 전적으로 의존합니다.
3. 25μL 마이크로 주사기(25G)를 70% 에탄올 3부피를 흡입하여 멸균하고 멸균 PBS-T 3량으로 추가로 헹굽니다.
4. 10μL의 BCG lux 접종물(섹션 1에서 준비) 또는 PBS-T를 멸균된 25μL 마이크로 주사기에 흡입합니다. PBS-T 음성 대조군에는 별도의 주사기를 사용하십시오.
   메모: 균일한 세포 현탁을 보장하기 위해 10회 주입 후 BCG lux 접종을 재현
탁합니다.
5. 핀셋을 사용하여 유충 한 마리를 집어 주입 플랫폼에 놓습니다.
6. 플랫폼에서 유충을 뒤로 뒤집고 핀셋으로 머리와 꼬리를 고정하여 고정시킵니다. 유충의 머리에서 카운트다운하여 마지막 왼쪽 앞다리를 찾고 바늘 끝(5-6mm)을 수평면에 대해 10-20° 각도로 조심스럽게 삽입합니다.
   메모: 짧고 좁은 핀셋은 최소한의 유충 스트레스로 쉽게 고정할 수 있습니다. 장을 뚫고 비 BCG 럭스 특이적 멜라닌화 또는 사망을 유발할 수 있는 과도한 침투에 주의하십시오.
7. 여과지 층이 늘어선 페트리 접시에 감염된 유충을 세면 단일 90mm 페트리 접시에 최대 30마리의 유충을 수용할 수 있습니다.
8. 유충이 들어있는 페트리 접시를 37 ° C의 인큐베이터 내부의 통풍 또는 밀봉되지 않은 어두운 상자에 5 % CO₂와 함께 보관하십시오.

4. 감염 후 G. melonella의 생존 모니터링

1. 시간이 지남에 따라 24시간마다 유충의 생존을 모니터링하십시오. 유충은 접촉에 반응하여 움직이지 않을 때 죽은 것으로 간주됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5ml 반응 튜브(Eppendorf)	에펜도르프	22431021
20, 200 및 1000 μl 피펫 및 여과된 팁	모든 공급업체	해당 없음
24웰 배양 플레이트	그라이너	662160
25ml 피펫 및 피펫 보이	모든 공급업체	해당 없음
3칸 페트리 접시(94/15mm)	그라이너	637102
원심 분리기	모든 공급업체	해당 없음
Class II 안전 캐비닛	모든 공급업체	해당 없음
벤트 캡이 있는 삼각 플라스크(250ml)	코 닝	CLS40183
에탄올 (>99.7%)	폭스바겐	제208221.321
갤러리아 멜로넬라 (pk당 250개)	Livefood Direct 영국	W250 (영어
글리세롤	시그마-알드리치	G5150
하이그로마이신 B	코 닝	30-240크롬
마이크로 주사기(25 μl, 25 ga)	증권 시세	3000
마이크로 원심분리기	모든 공급업체	해당 없음
미들브룩 7H11 한천	BD 생명과학	283810
미들브룩 7H9 육수	BD 생명과학	271310
Middlebrook ADC 농축	BD 생명과학	212352
Middlebrook OADC 농축	BD 생명과학	212240
마이코박테리움 보비스 BCG 럭스	다양한	해당 없음
N-데실 알데히드	시그마-알드리치	D7384-100G
오비탈 쉐이킹 인큐베이터	모든 공급업체	해당 없음
인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	P4417-100탭
폴리소르베이트 80 (트윈-80)	시그마-알드리치	P8074-500ml
작은 상자	모든 공급업체	해당 없음	어두운 통풍구 또는 밀봉되지 않은 상자 권장
트위터	모든 공급업체	해당 없음	짧고 좁은 팁/뭉툭한 긴 핀셋
페트리 접시(94/15mm)	그라이너	633181
여과지(94mm)	모든 공급업체	해당 없음	딱 맞게 잘라

호 ) 표시기 년 년