경요도 카테터 삽입 및 세균 접종을 통해 수컷 마우스에서 요로 감염 모델을 생성하다

초록

출처: Zychlinsky Scharff, A., et al. 작은 동물 모델의 요로 감염 : 수컷 및 암컷 마우스의 경요도 카테터 삽입. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 경요도 카테터 점안을 통해 암컷 마우스 방광에서 요병원성 대장균 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 주입된 박테리아는 방광 내에서 요로 감염을 성공적으로 확립하여 요로와 관련된 의료 관련 질병을 연구하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 카테터 준비

1. 감염될 각 마우스 그룹에 대해 하나의 소아 정맥 주사 접근 캐뉼라를 준비합니다. 내장된 스프링 메커니즘을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 바늘의 각 캐뉼라를 제거합니다. 바늘을 버리고 플라스틱 정맥 캐뉼라만 보존합니다.
2. 층류 후드에서 한 번의 자외선(U.V.) 주기(일반적으로 25 - 30분) 동안 카테터를 멸균합니다.
   참고: 카테터는 두 개 이상의 마우스에 사용할 수 있지만 실험 그룹, 성별 또는 박테리아 균주 간에 새 카테터를 사용해야 합니다.

2. 감염에 대한 요병원성 대장균의 준비

1. 감염 최소 2일 전에 멸균 접종 루프를 사용하여 얼어붙은 박테리아 스톡에서 UPEC를 적절한 경우 항생제가 포함된 Luria Broth(LB) 한천 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 37 °C에서 밤새 배양합니다. 플레이트는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.
2. 100ml 멸균 삼각 플라스크에 LB 플레이트의 단일 콜로니를 적절한 경우 항생제가 포함된 10ml LB를 접종하고 하룻밤(약 16 - 18시간) 동안 37°C에서 배양합니다.
   참고: standing culture는 감염에 필요한 type 1 pili의 발현을 허용합니다. 흔들리게 성장한 배양액은 필리 발현의 효율성이 떨어지므로 감염률이 일관되지 않습니다.
3. 하룻밤 배양의 광학 밀도(OD)₆₀₀을 측정하고 미리 결정된 성장 곡선을 사용하여 ml당 박테리아 수를 계산합니다. 예를 들어, UPEC 균주 UTI89의 경우 OD₆₀₀ = 0.35는 ml당 2 x 10⁸ CFU와 동일하므로 OD₆₀₀ = 2.4의 익일 배양은 ml당 13.7 x 10⁸ CFU와 동일합니다. 감염에 사용되는 모든 새로운 균주와 OD₆₀₀과 생존 가능한 박테리아 사이의 관계를 경험적으로 결정합니다.
4. 감염될 동물의 수를 고려하여 필요한 박테리아의 양을 결정하고 각 마우스는 50μl PBS에서 약 10개의⁷ CFU(Colony Forming Unit)를 받아야 합니다. 계산에 카테터와 주사기 너브의 ~130μl의 데드 볼륨과 접종물을 결정하는 데 필요한 100μl를 포함합니다.
   1. 17,000 x g의 탁상용 마이크로 원심분리기에서 박테리아 현탁액을 1분 동안 회전시키고 생성된 박테리아 펠릿을 PBS에서 ml당 2 x 10^8CFU로 재현탁합니다. 이 현탁액의 분취액을 연속적으로 희석하고 LB 한천에 플레이트화하고 적절한 경우 항생제를 투여하여 각 감염에 대한 정확한 접종물을 결정합니다.
5. 세균 접종물을 1ml 주사기에 넣고 카테터를 주사기 끝에 부착합니다. 주사기를 두드려 공기를 제거하고 주입을 시작하기 전에 플런저를 눌러 카테터의 죽은 공기 공간을 채웁니다.

3. 마우스 준비

1. 100mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진의 복강 내 주사를 통해 마우스를 마취합니다. 추가 열을 제공할 수 있습니다.
2. 중간 압력으로 풋패드를 눌러 각 마우스가 완전히 진정되었는지 확인합니다. 생쥐는 반응하지 않을 때 완전히 진정되고 이 상태에 도달하는 데 3-5분이 걸립니다.
3. 생쥐를 누운 자세로 놓고 하복부에 중간 정도의 압력을 가하여 방광에서 소변을 비웁니다. 가득 찬 방광은 장골능 사이의 피부 아래에 있는 완두콩처럼 느껴집니다.
   참고: 흡입 이소플루란은 암컷 마우스의 카테터를 삽입하는 데 사용되었지만, 이 절차를 위해 수컷 마우스가 흡입 이소플루란으로 충분히 마취되었는지 여부는 테스트되지 않았습니다.

4. 수컷 마우스의 경요도 주입

1. 두 개의 엄지 집게를 두개골 및 꼬리 방향으로 마우스의 외부 생식기에 놓습니다. 포포를 집어넣어 귀두 음경을 완전히 드러냅니다. 음경이 바깥쪽에 배치되면 엄지 집게를 놓습니다.
2. 튀어나온 음경을 동물과 수직으로 고정하기 위해 집게의 위치를 조정하고 장기를 부드럽지만 팽팽하게 잡습니다. 요도 육체를 시각화하고 장기 끝에 있는 작은 구멍에 카테터를 조심스럽게 삽입합니다. 카테터를 음경 안으로 부드럽게 안내하여 마우스의 몸체를 향해 집게로 부드러운 장력을 유지합니다. 카테터는 윤활이 필요하지 않습니다. 카테터를 음경에 억지로 밀어 넣지 마십시오. 카테터는 요도로 부드럽게 미끄러져 들어가야 하며, 이는 올바른 위치를 나타냅니다.
3. 카테터의 허브가 음경의 끝과 만나면 음경의 위치를 유지하면서 매우 천천히 50μl의 접종물을 분배합니다. 이때 주입의 품질은 그림 1에 표시된 것과 같이 미리 결정된 주입 품질 점수에 따라 기록될 수 있습니다.
4. 접종물의 누출을 방지하기 위해 카테터를 5번 이상 천천히 집어넣습니다. 쥐를 케이지에 누운 자세로 놓습니다. 동물은 마취제 투여 후 30-45분 후에 회복하기 시작해야 합니다.

결과

그림 1: 점안의 품질은 감염 후 24시간 시점의 세균 부담과 상관관계가 없습니다. 6-8주 된 암컷 및 수컷 C57Bl/6 마우스에 10⁷ CFU의 UPEC을 주입했습니다. 각 주입 직후, 한 명의 연구자가 특정 기준(박스형 텍스트)에 의해 정의된 대로 주입에 품질 점수를 할당했습니다. 감염 후 24시간 후, 방광을 무균 방식으로 제거하여 박테리아 부담을 계수했습니다. 이 플롯은 CFU/방광에 대한 할당된 품질 점수를 보여줍니다. 각 점은 하나의 마우스이며 5개의 풀링된 실험이 표시됩니다. p = 0.17, Kruskal-Wallis 검정은 각 열의 평균 순위를 다중 비교를 위한 사후 Dunn 검정을 사용하여 다른 모든 열의 평균 순위와 비교합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BD Insyte Autoguard 차폐 IV 카테터 24G, 외경 0.7mm, 길이 14mM	(주)비디메디컬	381811 또는 381411*	* 카탈로그 번호는 국가에 따라 다릅니다.
접종 루프	Greiner 바이오 원	731171
주사기	B 브라운	9166017V
엄지 (Adson) 집게	정밀 과학 도구	11006-12
인슐린 주사기	테루모	BS05M2913
5ml 튜브, 폴리프로필렌	송골매	352063
LB 밀러 브로스	디프코	244620
LB 밀러 한천	디프코	244520
큐 벳	바이오 라드	Tel.: 223-9955