유세포 분석을 사용한 요로병원성 대장균 감염 마우스 방광 조직의 면역 세포 침투 정량화

초록

출처: Zychlinsky Scharff, A. et al., 소동물 모델의 요로 감염: 수컷 및 암컷 마우스의 경요도 카테터 삽입술. J. Vis. 특급. (2017년)

이 비디오에서는 대장균에 감염된 마우스 방광에서 CD45⁺ 면역 세포를 정량화하여 면역 세포 침투를 측정하는 유세포 분석 기반 기술을 시연합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 방광 조직의 유세포 분석

1. 34 units/mL의 콜라겐 분해 효소와 100 μg/mL의 DNase를 포함하는 분해 완충액을 PBS로 준비합니다. 얼음 위에 보관하십시오. 분석할 동물당 1개의 15ml 원뿔형 튜브를 준비하고 튜브당 1ml 분해 버퍼를 분취합니다.
2. 미리 결정된 시점에 승인된 표준 운영 절차(예: 자궁경부 탈구 또는 이산화탄소 과다 복용)에 따라 마우스를 희생시킵니다. 복부를 70% 에탄올로 철저히 적셔 털에 의한 오염을 최소화합니다.
3. 가위를 사용하여 마우스의 복부 아래쪽 1/3을 2cm 이상 절개하고 방광 전체를 제거합니다. 가위로 잘 다져서 방광을 2 - 3 mm,² 크기, 일반적으로 약 8 조각으로 자릅니다.
   1. 소화 완충액이 들어 있는 튜브당 다진 방광 1개를 추가합니다. 흔드어 다진 방광 조직을 소화 완충액으로 씻어냅니다. 모든 방광이 절개되고 다질 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
4. 다진 방광을 37 °C에서 60 - 75 분 동안 배양하고 15 분마다 5 초 동안 손으로 세게 흔듭니다. 조직이 젖은 티슈 페이퍼와 유사한 유리처럼 투명한 모양을 가지면 소화가 완료된 것입니다. 장시간 소화는 식별에 필요한 세포에서 표면 단백질을 제거하므로 피해야 합니다.
5. 2 - 3 mL의 얼음-저온 유세포 분석 완충액(2% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.2 mM EDTA를 함유한 PBS)을 첨가하여 분해 효소를 비활성화하고 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에 튜브를 놓습니다.
6. 단일 세포 현탁액을 보장하고 결합 조직을 제거하려면 15mL 원추형 튜브에 배치된 100μm 필터를 통해 튜브의 내용물을 통과시킵니다. 주사기 플런저 끝으로 필터를 통해 남아 있는 조직을 부드럽게 누릅니다. 추가 2mL 유세포 분석 버퍼로 필터를 세척합니다. 얼음 위에 샘플을 보관하십시오.
7. 200 x g, 4 °C에서 7분 동안 원심분리로 시료를 세척합니다.5 μg/mL로 희석된 Fc 블록을 포함하는 100 μL 유세포 분석 버퍼에 펠릿을 재현탁하고 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮깁니다. 10 - 15분 후 각 샘플에 원하는 항체 칵테일 100μL를 추가합니다. 빛을 차단한 얼음 위에서 30 - 45분 동안 샘플을 배양합니다.
   메모: Fc block은 항체의 Fc 부분이 Fc 수용체를 발현하는 세포에 결합하는 것을 방지하기 위해 사용되는 시약입니다. 그 목적은 비특이적 항체 결합을 최소화하는 것입니다. 사용할 항체의 결정은 실험에서 테스트되는 가설에 따라 달라지며 문헌의 입력에 따라 선택해야 합니다. 그림 1에서는 전반적인 면역 세포 침투를 측정하기 위해 범면역 세포 단백질인 항-CD45 항체를 사용했습니다.
8. 200 x g, 4 °C에서 7분 동안 원심분리로 시료를 세척합니다. 세포 펠릿을 200 μL 유세포 분석 버퍼에 재현탁하고 유세포 분석기에서 획득하기 직전에 5 ml 폴리스티렌 튜브의 40 μm 세포 여과기를 통해 시료를 통과시킵니다.
9. 유세포 분석기에서 전체 샘플을 수집합니다. 잘 소화되면 200,000 - 400,000개의 세포가 생성되며, 이 중 8,000 - 10,000개의 CD45⁺ 면역 세포가 없는 쥐 방광에서 생성되는 반면, 감염된 장기에는 더 많은 세포가 있습니다(그림 1).
   메모: 유세포 분석을 위해 준비된 샘플은 CFU를 평가하는 데 사용할 수 없습니다. 방광을 두 부분으로 나누는 것은 요병원성 대장균(UPEC) 집락 형성 또는 면역 세포 침투가 조직 전체에 걸쳐 균일하다는 것을 입증하는 증거가 없기 때문에 권장하지 않습니다.

결과

그림 1: 요로감염에 대한 반응으로 암컷 마우스에서 면역 세포 침투가 증가합니다. 6주에서 8주 된 암컷 및 수컷 C57Bl/6 마우스에게 10⁷ CFU의 UPEC를 주입하거나 주입하지 않았습니다. 대표적인 점도표는 순진하거나 감염된 마우스의 분홍색으로 코팅된 CD45⁺ 면역 세포를 가진 전체 방광 세포를 나타냅니다. 이 그래프는 순진한 마우스 또는 24시간 감염된 마우스의 방광에 있는 CD45⁺ 면역 세포의 절대 수를 보여줍니다. 각 점은 하나의 마우스이며 2개의 풀링된 실험이 표시됩니다. Mann-Whitney 검정에 의해 결정되는 p-값.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
주사기	B 브라운	9166017V
엄지 (Adson) 집게	정밀 과학 도구	11006-12
5mL 튜브, 폴리프로필렌	송골매	352063
조직 파열기 일회용 프로브	키아겐	990890
15 mL 플립 캡 튜브	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	362694
DNA제	인비트로젠	18047019
100μM MACS 스마트 스트레이너	밀테니	Tel.: 130-098-463	15 mL 튜브와 호환 가능, 선호
100μm 셀 스트레이너	송골매	제352360	50mL 튜브와 호환(MACS Smart Strainer를 사용할 수 없는 경우)
96웰 플레이트	송골매	353077
FC 블록	BD 파밍겐	553142	안티 CD16/CD32
안티-마우스 CD45 항체	BD 바이오사이언스	561487	다양한 형광 접합 옵션을 사용할 수 있습니다
5 mL 튜브 폴리스티렌(필터 캡 포함)	송골매	352235
휴대용 균질화기	키아겐	9001272	티슈럽터
유세포 분석기	BD 바이오사이언스	해당 사항 없음	포르테사 SORP
유세포 분석 소프트웨어	BD 바이오사이언스	해당 사항 없음	디바