생체 외 장기 배양에서 박테리아 감염 모델을 확립하는 기술

초록

출처: Rizzuto, G. A., et al. 모체-태아 계면에서 감염을 연구하기 위한 인간 태반 및 방치 장기 배양. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 감염 전파를 연구하기 위해 태반 조직에 감염 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. 체외 태반 장기 배양은 통성 세포 내 기생충인 Listeria monocytogenes에 감염되어 있습니다. 박테리아는 외부 영양막아세포(EVT)에 침입하여 태반 조직에 들어간 다음 세포 간 확산을 통해 다른 세포로 증식합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 장기 배양 플레이트의 준비

참고: 다음 단계는 조직 배양 후드에서 멸균 기술을 사용하여 수행해야 합니다. 해부 현미경이 멸균 영역에 위치하는 것이 이상적입니다. 그러나 미세 박리가 신속하게 수행되고 기구가 70% 에탄올에 자주 담그는 한 이는 절대적으로 필요한 것은 아닙니다.

1. 얼음 위에서 세포외 기질(ECM) 바이알을 해동합니다. ECM을 얼음처럼 차가운 수집 매체로 1:1로 희석하고 피펫팅으로 혼합합니다. 거품이 생기지 않도록 천천히 피펫을 삐걱거립니다. 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에는 100μl의 현탁액이 필요하며 3-4개의 장기 배양을 수용할 수 있습니다.
2. 트랜스웰 삽입물(공극 크기 0.4μM)을 6웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 배치합니다.
3. 각 트랜스웰 인서트를 ECM/매체 현탁액의 얇은 층(100μl)으로 코팅합니다.
4. 접시를 얼음 위에 놓고 즉시 장기 배양 단계로 진행합니다. 또는 조직 채취 전에 플레이트를 준비하고, 이 경우 파라 필름으로 싸서 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 보관합니다. ECM이 건조되므로 6시간 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다.

2. 장기 배양의 확립

참고: 이 단계에서는 탈피 장기 배양과 융모 장기 배양을 별도의 트랜스웰에 배치하는 방법을 설명합니다. 조직이 접촉하지 않습니다. 데시두아(decidua)와 융모(villi)가 서로 직접 접촉하는 공동 배양 기술에 관심이 있는 연구자들은 이전 문헌을 참조할 수 있습니다.

1. 수집 매체에서 표본을 두 번 헹구고 각 헹굼 사이에 1,000 x g에서 원심분리합니다. 조직을 멸균된 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경의 스테이지에 놓습니다. 현미경에 인접한 얼음 위에 6웰 플레이트를 보관하십시오.
2. 멸균 스프링거 해부 가위와 집게를 사용하여 조직을 미세 해부하여 2-3mm 융모 장기 배양을 확립합니다(그림 1A).
   메모: 융모 기관 배양은 2개 또는 3개의 가지가 있고 눈에 띄는 EVT(extravillous trophoblast) 세포 기둥이 있는 작고 혈관이 잘 형성된 "나무"입니다. 임신 초기에 외융모세포(extravillous trophoblast)가 ECM으로 침입하는 것이 가장 두드러지기 때문에 <9주 초반의 융모 조직만 활용하는 것이 중요합니다.
3. 두드러진 EVT 세포 기둥이 있는 잘 혈관화된 융모를 선택합니다. EVT 세포 열은 구근 모양, "흐릿한", "푹신한" 끝으로 시각화됩니다(그림 1A의 화살촉 참조).
4. 멸균 집게를 사용하여 3개 또는 4개의 융모 나무를 각 트랜스웰로 옮깁니다. 나무가 ECM 위에 평평하게 배치되고 덩어리진 가지를 분리하도록 가지를 조정합니다.
5. 멸균 스프링거 해부 가위와 집게로 탈피 조직을 미세 절개하여 3mm³ 탈피 장기 배양을 확립합니다(그림 1A).
   메모: 표본에는 두 가지 유형의 탈피 조직, 즉 decidua parietalis와 decidua capsularis(각각 왼쪽 및 오른쪽 조직 조각, 그림 1A)가 포함되어 있습니다.
6. 가위로 다듬어 3mm³개의 decidua parietalis를 만듭니다. Decidua capsularis는 이러한 배양에 사용되지 않습니다. 집게를 사용하여 응고된 모성의 피를 닦아내십시오.
7. 멸균 집게를 사용하여 3-4개의 decidua 조각을 각 트랜스웰로 옮깁니다.
8. 웰 바닥에 수집 매체 1ml를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 밤새 플레이트를 배양합니다.
9. 정상적인 임신 초기의 태반 산소 장력을 모방하는 것이 중요한 실험의 경우, 상대적 저산소증(3% O₂)에서 융모 장기 배양을 유지합니다.
   메모: 실험실 옵션에는 기존 인큐베이터 내부에 맞는 소형 저산소증 인큐베이터 챔버 또는 산소 농도를 낮추기 위해 외부 N₂ 가스를 도입하는 트라이 가스 인큐베이터가 포함됩니다.
10. 배양 12-16시간 후 트랜스웰 상단에 1ml의 융모 또는 데시듀얼 배지(표 1)를 추가합니다.
    메모: 배양에서 첫 하룻밤 동안 배지가 없으면 외부 영양막 세포 기둥이 침입하고(융모 배양) 조직(융모 및 데시잔성 모두)이 ECM에 안전하게 내장될 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면, 탈피 장기 배양은 72시간 동안, 융모 장기 배양은 96시간 동안 생존 가능합니다. 이 기간 내에 속하는 실험적 종점을 권장합니다. 융모 배지와 데시듀얼 배지의 구성에 대해서는 표 1을 참조하십시오. 융모 배지는 FBS 비율이 높은 반면, 데시듀얼 배지는 탈유산 상태를 유지하는 임신 호르몬(프로게스테론, 17β-에스트라디올)이 보충됩니다(표 1).

3. L. monocytogenes 배양의 준비

참고: L. monocytogenes의 장기 보관, 뇌 심장 주입(BHI) 육수 및 한천에서 이 유기체의 배양 및 성장에 대한 자세한 프로토콜은 Wang et al.을 참조하십시오.

1. 줄무늬가 있는 BHI 한천 플레이트에서 단일 L. monocytogenes 콜로니를 선택하고 BHI 육수 3ml를 접종합니다.
2. L. monocytogenes 배양을 30°C에서 비스듬한 위치에서 하룻밤(16시간) 동안 배양합니다.
   메모: 이러한 배양 조건은 박테리아 성장이 고정상에 도달할 수 있도록 합니다. L. monocytogenes는 30°C에서 편모를 형성하여 숙주 세포의 침입을 증가시킵니다.

4. L. monocytogenes에 의한 장기 배양 감염

1. 37°C까지의 온난한 인산염 완충 식염수(PBS) 및 융모 또는 데시듀얼 배지(표 1).
2. 멸균 핀셋을 사용하여 ECM을 침범하지 않아 우물에 떠 있는 장기 배양 조각을 제거합니다.
3. 트랜스웰 바닥에서 매체를 조심스럽게 흡입합니다. 따뜻한 PBS 1ml를 웰에 부드럽게 피펫팅하여 상부 및 하부 트랜스웰을 두 번 헹구고 그 사이에 조심스럽게 흡인합니다. 항생제가 없는 융모 또는 데시듀얼 배지 1ml를 상부 및 하부 트랜스웰에 부드럽게 피펫팅합니다. 장기 배양을 방해하지 않도록 주의하세요.
4. 항생제가 제거된 것을 확인하기 위해 최소 한 시간 동안 항생제가 없는 배지에서 조직을 배양합니다.
   메모: 고정상에서 L. monocytogenes 배양의 밀도는 ml당 약 1 x 10⁹ 집락 형성 단위(CFU)입니다. 장기 배양을 감염시키는 데 사용되는 박테리아의 수는 실험적 요구 사항을 충족하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다.
5. 야생형 L. monocytogenes의 경우, 일상적인 감염 실험에서 하룻밤 사이에 1:50으로 희석하는 강력한 침입을 보여줍니다(웰당 배지 1ml에 4 x 10⁷ L. 모노사이토제네스). 적절한 수의 박테리아를 항생제가 없는 융모 또는 데시듀얼 배지에 재현탁합니다.
6. 트랜스웰 상단에서 미디어를 흡입합니다. 접종물 1ml를 부드럽게 첨가합니다. 박테리아 침입을 허용하기 위해 37 ° C에서 5 % CO₂로 플레이트를 배양합니다.
7. 상부 및 하부 트랜스웰에서 배지를 흡인하여 세포외 박테리아를 제거합니다. 따뜻한 PBS로 우물을 두 번 헹굽니다. 50μg ^ml-1 겐타마이신이 보충된 융모 또는 데시듀얼 배지 1ml를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂.
   로 플레이트를 배양합니다. 참고: L. monocytogenes는 세포 외 매질에서 성장하고, 세포 내부에서 성장하며, 세포 외 공간에 접근하지 않고도 세포에서 세포로 퍼질 수 있는 통성 세포 내 박테리아입니다. 겐타마이신은 세포외 L. monocytogenes에 살균 효과가 있으므로 세포 내 L. monocytogenes의 성장 및 장기 배양을 통한 확산을 측정할 수 있습니다.
   메모: 융모 및 데시두아 장기 배양의 재현 가능한 L. monocytogenes 감염은 5시간의 배양 시간으로 발생합니다. 겐타마이신을 첨가하기 전의 배양 시간은 실험적 필요성과 유기체가 조직에 침입할 수 있는 능력에 따라 수정될 수 있습니다. 감염에 가장 취약한 해부학적 부위를 더 잘 이해하기 위해 더 짧은 배양 시간을 사용할 수 있습니다.
8. 실험 기간 동안 플레이트를 37°C에서 5% CO₂로 유지합니다. 각 웰의 전체 매체를 매일 교체하십시오.
   메모: 우리의 경험에 따르면, L. monocytogenes에 감염된 탈피 장기 배양은 48시간 동안 생존할 수 있으며, 융모 장기 배양은 72시간 동안 생존할 수 있습니다.

표 1: 미디어 레시피. Wash buffer, Collection medium, Villous medium 및 Decidual medium의 준비를 위한 성분 및 농도

세척 버퍼	수집 매체	융모 매체	데시듀얼 미디엄
PBS (PBS)	GlutaMAX를 사용한 DMEM/F-12	GlutaMAX를 사용한 DMEM/F-12	GlutaMAX를 사용한 DMEM/F-12
페니실린 100 IU / ml	소 태아 세럼 2.5%	소 태아 세럼 20%	소 태아 세럼 2.5%
스트렙토마이신 100μg/ml	페니실린 100 IU / ml	페니실린 100 IU / ml	17β-에스트라디올 300pg/ml
겐타마이신 50 μg/ml	스트렙토마이신 100μg/ml	스트렙토마이신 100μg/ml	프로게스테론 20ng/ml
암포테리신 B 1.25μg/ml	겐타마이신 50 μg/ml
	암포테리신 B 1.25μg/ml

결과

그림 1: 융모 기관 배양 – 대표적인 총체적 및 현미경적 이미지.

(A) 해부 현미경으로 본 재태 연령이 6주인 두 그루의 말단 융모 나무. 왼쪽에 있는 나무의 가지를 통해 흐르는 "푹신한" 끝(화살촉)과 눈에 띄는 태아 혈관 구조가 이 조각을 장기 배양에 적합하게 만듭니다. (B) 장기 배양의 면역 형광 현미경 검사(재태 연령 8.3주) 리스테리아 모노사이토제네스 감염 후 72시간, 외부 영양막아세포에서 무거운 박테리아 부담[녹색]을 강조합니다. DAPI는 파란색으로, βHCG+ syncytiotrophoblast는 빨간색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 1mm(A), 250μm...

재료

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