검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
주의: 인간 혈액 샘플과 인간 말라리아 기생충을 다루려면 예방 조치가 필요합니다. 항상 실험복과 장갑을 착용하고 레벨 2 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오. 인간 말라리아에 우발적으로 경피적으로 노출된 경우, 예방 치료를 위해 보건 및 안전에 보고하십시오. 인간 면역 결핍 바이러스 HIV(+) 혈액을 다루기 위해서는 추가적인 안전성 고려 사항도 마련해야 합니다. 등을 닫는 실험복을 입습니다. 더블 장갑 (상단 장갑은 라텍스여야 함). 레벨 2 생물 안전 캐비닛에서 모든 취급을 수행하십시오. 유리나 날카로운 물건을 사용하지 마세요. 흡인기는 사용하지 마십시오. 오염된 모든 품목을 버리기 전에 최소 1시간 동안 바이록스 용액 또는 표백제에 넣으십시오. 사용 후 1시간 동안 바이록스와 자외선(UV)으로 모든 표면을 세척하십시오. 각 기관에는 따라야 할 고유한 생물 안전 규정이 있습니다. HIV에 감염된 혈액에 대한 모든 우발적 노출은 노출 후 가능한 예방에 대한 평가 및 고려를 위해 Health and Safety에 보고하십시오.
참고: P. falciparum 말라리아 기생충의 다양한 균주가 존재합니다. 이러한 실험에는 ITG가 사용되었지만 다른 균주를 사용할 수 있습니다. Plasmodium falciparum 기생충의 냉동 및 해동에 대한 훌륭한 지침은 MR4 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.
1. 말라리아 기생충 배양을 위한 RPMI-A 만들기
- 이중 증류수(ddH2O) 950ml, Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 분말 1패킷, N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid(HEPES) 6g, 중탄산나트륨 2g, 하이포잔틴 1.35mg을 혼합하여 RPMI-0를 만듭니다.
- 두 개의 다른 기증자로부터 열 비활성화 인간 혈청을 해동합니다. AB 기증자가 가장 좋지만 O형 적혈구(RBC)에서 기생충이 자란 경우 어떤 기증자도 사용할 수 있습니다. 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 혈청에 미립자 물질이 포함되어 있거나 두꺼운 경우 2,000rpm으로 회전한 다음 0.45μm 필터 장치를 사용하여 액체 부분을 여과합니다.
- 0.2μm 필터 유닛을 사용하여 RPMI-0 180ml, 인간 혈청 20ml(각 기증자당 10ml) 및 10mg/ml 겐타마이신 0.5ml를 필터링합니다.
메모: 인간 혈청은 필터를 막을 수 있으므로 두 개 이상의 필터 장치가 필요할 수 있습니다.
- 중간 크기의 병에 RPMI-A, 날짜, 세럼 출처를 표시합니다. 필요할 때까지 냉장 보관하십시오. RPMI-A는 냉장 보관하면 탁해질 수 있습니다. 이것은 정상이지만 흐림이 증가하는 것은 오염의 신호입니다.
메모: 기생충 성장은 기증자 혈청에 따라 다를 수 있습니다. 사용하기 전에 모든 인간 혈청 배치를 테스트하여 기생충이 잘 자랐는지 확인하는 것이 좋습니다.
2. 기생충 배양을 위한 인간 적혈구 준비
참고: 헌혈자는 O형이어야 합니다.
- 7-10ml의 혈액을 ACD(acid-citrate-dextrose) 튜브에 모으십시오. 라벨에 기증자의 ID와 수집 날짜를 적으십시오.
- 필요할 때까지 혈액을 4 oC에서 보관하십시오. 1개월 이내에 기생충 배양을 위해 혈액을 사용하십시오.
- 튜브 상단을 70% 에탄올로 닦습니다. 마개를 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 15ml 튜브에 혈액을 옮깁니다. 1,000 x g에서 3분 동안 회전합니다. 흡인에 의한 플라즈마를 제거합니다.
- 동일한 양의 따뜻한 RPMI-0으로 RBC를 매달아 놓습니다. 1,000 x g에서 5분 동안 회전합니다. 흡인에 의해 버피 코트를 제거하고 RPMI-0 5ml에 재현탁한 다음 세척을 2회 더 반복합니다.
- 상층액을 제거하고 RPMI-A를 충분히 첨가하여 적혈구 부피가 50%인 혼합물을 생성합니다.
- 필요할 때까지 4 oC에서 보관하십시오.
3. 기생충 문화 유지
- RPMI-A를 37°C로 예열
- 해동된 기생충(해동 절차는 MR4 프로토콜 참조)을 RPMI-A 5ml와 세척된 인간 적혈구 75μl가 있는 T25 플라스크에 넣고 ~3%의 헤마토크릿을 만듭니다. 메모: 헤마토크릿은 총 부피와 비교하여 RBC의 부피를 측정합니다. 헤마토크릿을 계산하려면 배지와 적혈구의 총 부피에 대한 충전된 적혈구의 부피를 측정합니다. 해동된 기생충이 75μl의 적혈구를 제공한다고 가정합니다. 플라스크에 150μl의 RBC 스톡(포장된 적혈구 75μl을 추가하는 것과 동일)을 추가하면 5ml의 배지에 총 150μl의 적혈구가 생성되며, 이는 3%(150μl/5,000μl x 100% = 3%)의 헤마토크릿과 같습니다.
- 플라스크에 기생충 가스 혼합물(1% O2, 3% CO2, 균형 N2)로 30초 동안 가스를 공급합니다. 가스 교환을 위한 가장 큰 표면적을 허용하기 위해 37 oC 인큐베이터에서 플라스크의 넓은 면이 아래로 향하게 하여 밀봉하고 놓습니다.
- 배지를 변경하고 기생충혈증을 확인하려면(매일 수행해야 함) 적혈구 층을 방해하지 않도록 플라스크를 조심스럽게 움직입니다. 멸균 unplugged 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈액층을 방해하지 않고 배양 배지를 추출합니다.
- 기생충을 확인하려면 혈액층에서 10μl의 샘플을 제거하여 유리 슬라이드에 놓고 두 번째 유리 슬라이드를 사용하여 얇은 혈액 막을 만듭니다. 슬라이드를 건조시킵니다.
- 새로운 RPMI-A 4ml를 플라스크에 넣고 부드럽게 섞은 다음 30초 동안 가스를 주입한 다음 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 Hema3 염색 키트를 사용하여 슬라이드를 염색합니다.
- 최적의 염색을 위해 슬라이드를 고정 용액에 10초 동안, 용액 I에 10초, 용액 II에 30초 동안 담그십시오. 물로 헹구고 슬라이드를 건조시킵니다.
- Plasmodium falciparum RBC, PfRBC(짙은 보라색으로 염색됨)의 수와 RBC(분홍색으로 염색됨)의 총 수를 세어 기생충혈증을 계산합니다. 정확성을 보장하기 위해 총 300개의 셀을 계산합니다.
- 기생충혈증이 5%에 도달하면 RPMI-A 40ml와 적혈구 500μl를 사용하여 배양물을 T75 플라스크로 확장합니다.
4. 기생충 동기화
참고: 실험 전날에는 알라닌으로 처리하여 기생충 배양을 동기화합니다. 고리 단계 기생충과 감염되지 않은 적혈구만이 이 치료에서 살아남을 수 있습니다. 알라닌 동기화는 다음 날 공동 배양 실험에 사용할 수 있는 순수한 영양영양 배양을 제공합니다. 대부분의 고리 단계 기생충을 포함하는 기생충 배양부터 시작해야 합니다.
- 알라닌 8.01g(300mM)과 트리스(10mM) 0.365g을ddH2O300ml에 혼합하여 알라닌 용액을 제조하고 pH를 7.4로 올린다. 필터는 0.2μm 필터 장치를 사용하여 멸균합니다.
- 알라닌 용액을 37 oC로 예열합니다.
- 기생충 배양액(5분 x 1,000 x g)을 스핀다운하고 배지를 제거합니다.
- 펠렛을 19 부피의 알라닌 용액 (1 ml 포장 된 RBC에서 19 ml의 알라닌 용액)에 재현탁시킵니다. 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 스핀 5 분 x 1,000 x g. 흡인 상층액. RPMI-0으로 한 번 세척하십시오. 상층액을 흡인하고 RPMI-A에 재현탁하고 헤마토크릿을 ~3%로 조정합니다. 가스 플라스크 및 37 oC.
로 복귀
메모: 공동 배양 실험의 경우 최소 5%의 영양동물의 기생충혈증이 필요하며 10%의 기생충혈증이 최적의 것으로 간주됩니다.
5. 공동 배양 실험을 위한 기생충 및 적혈구 준비
- 염증 반응을 유도하기 위해 공동 배양 실험에서 PBMC 당 3 PfRBC의 비율을 사용합니다. 총 PfRBC를 계산하려면 3.5에 설명된 대로 얇은 혈액 도말로 기생충혈증을 정량화하고, 혈구계를 사용하여 기생충 배양 mL당 적혈구 수를 계수하여 헤마토크릿을 정량화합니다.
PfRBC 수 = % 기생충혈증 x 총 RBC/ml x 배양액 ml. 예를 들어, 10 x 106 RBC/ml 및 10% 기생충혈증에서 10ml의 배양액은 0.1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC와 같습니다.
- 기생충 배양을 1,000 x g(RT)에서 5분 동안 회전시킵니다. 배지를 흡인하고 RPMI-S+(L-글루타민 및 HEPES가 보충된 500ml RPMI-1640, 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 1.5ml 겐타마이신, 100mM 피루브산 나트륨 5ml, 10mM MEM 비필수 아미노산 5ml, 5mM β-메르캅토에탄올) ml당 6 x 10 PfRBC로 재현탁합니다.
- 대조군 혈액(기생충 배양을 유지하는 데 사용된 것과 동일한 기증자로부터 감염되지 않은 적혈구)을 채취하여 헤마토크릿을 계산한 다음 기생충 배양과 동일한 ml당 적혈구 수만큼 RPMI-S+에 재현탁합니다.
6. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리
- 만성 HIV(+) 기증자와 HIV(-) 대조군 모두로부터 나트륨 헤파린 튜브(녹색 상단)에 정맥혈을 수집합니다. EDTA의 칼슘 킬레이트 작용은 세포 기능에 영향을 미치므로 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 항응고제로 사용하지 마십시오. 평균적으로 혈액 10ml당 5-10 x 106 PBMC 사이가 예상됩니다. 일반적인 실험의 경우 각 헌혈자로부터 30ml의 혈액을 수집합니다. 혈액량은 실험 요구 사항에 따라 조정해야 합니다.
- 가능한 한 빨리, 그리고 혈액을 채취한 후 한 시간 이내에 튜브에서 혈액을 제거하고 플라스틱 50ml 튜브에 넣으십시오. 특히 단핵구는 활성화되어 유리에 달라붙기 때문에 유리 채혈관을 사용하는 경우 가능한 한 빨리 세포를 제거하는 것이 중요합니다.
- 1,000 x g에서 15분 동안 혈액을 회전시키고 혈장을 수집합니다(필요한 경우 다른 연구에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 이 단계를 건너뛸 수 있음). 혈액을 같은 양의 차가운 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)으로 희석합니다.
- RT Ficoll 15ml를 50ml 튜브에 넣습니다. 멸균 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 천천히 혼합하지 않고 Ficoll 위에 혈액/DPBS 용액을 겹겹이 쌓습니다. 최대 25ml의 혈액/DPBS 용액을 각 15ml의 Ficoll 위에 겹쳐 놓을 수 있습니다.
- 600 x g에서 RT로 30분 동안 그라디언트를 회전합니다. '브레이크 없음' 설정이 켜져 있는지 확인합니다.
- 셀이 회전하면 두 단계 사이의 인터페이스를 찾습니다. 이것이 PBMC가 있는 곳입니다. 멸균 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 인터페이스에서 PBMC를 수집합니다(그림 1 참조). 적혈구에 의한 오염을 최소화합니다.
- 수집된 세포를 튜브당 20ml 이하로 50ml 튜브에 넣습니다. 멸균 콜드 DPBS가 있는 최대 50ml의 탑 튜브.
- 300 x g에서 4 oC에서 10 분 동안 세포를 회전시킵니다.
- 상등액을 버리고 펠릿을 5ml 멸균 저온 DPBS에 재현탁시킨 다음 동일한 공여자의 모든 세포를 하나의 튜브에 모읍니다. 멸균 DPBS를 최대 50ml까지 붓고 세척 단계를 2회 더 반복합니다.
- 10ml RPMI-S+ 배지에 세포를 재현탁합니다.
- 20μl의 부분 표본을 제거하고 20μl의 트리판 블루와 섞습니다. 혈구계에 10μl를 피펫팅하고 살아있는 세포(파란색 염료를 채택하지 않은 세포 – 모든 파란색 세포는 죽었습니다)를 계산합니다. 혈구계를 사용하여 다음과 같이 용액의 세포 수를 계산합니다.
메모: 혈구계에는 선으로 덮인 영역을 알 수 있도록 지정된 치수의 그리드가 있습니다.
- 혈구계가 깨끗한지 확인하십시오. 계수 영역 위에 커버슬립을 놓습니다. 피펫 팁을 V자형 웰 중 하나에 넣어 10μl의 세포 용액을 로드합니다. 커버슬립 아래 영역은 모세관 작용으로 채워집니다.
- 로드된 혈구계를 현미경 아래에 놓습니다. 혈구계의 전체 그리드에는 각각1mm2의 9개의 정사각형이 있습니다. 각 큰 사각형 안에 있는 모든 셀의 수를 셉니다. 세포가 너무 많으면 용액을 더 희석하고 다시 계산합니다.
- 다음과 같이 세포 농도를 계산합니다: 총 세포/ml = (계수된 총 세포/제곱 #) x 희석 계수 x 10,000 cells/ml(예: (500 세포/5 제곱) x 20의 희석 계수 x 10,000 cells/ml = 20 x 10총 6 세포.
- 배지를 ml당 10 x 106의 최종 농도(RPMI-S+ 배지)로 조정합니다.
7. 말라리아/HIV 동시 감염 문화
- 100μl의 분리된 PBMC와 400μl의 RPMI-S+ 배지를 24웰 플레이트(웰당 1 x 10,6 PBMC)로 플레이트합니다. 감염되지 않은 적혈구를 위한 3개의 웰, PfRBC를 위한 3개의 웰, 중간을 위한 3개의 웰, PMA/아이오노마이신을 위한 3개의 웰로 웰이 설정되었는지 확인합니다. 이것은 HIV(+) 및 HIV(-) 샘플에 대한 것입니다.
- PfRBC 웰의 경우 각 웰에 3 x 106 PfRBC를 배치합니다(5.2에서 준비된 500μl의 기생충 배양).
- 감염되지 않은 적혈구 웰의 경우, 5.3으로 준비된 감염되지 않은 적혈구 배양 500 μl를 각 웰에 배치합니다.
- 중간 웰의 경우 각 웰에 500μl의 RPMI-S+ 배지를 배치합니다.
- PMA/아이오노마이신 웰의 경우 PMA/아이오노마이신 용액(각각 2.5pg/ml, 250pg/ml)을 준비합니다. 이 용액 500μl를 각 웰에 넣습니다.
메모: T 세포 사이토카인 분비의 강력한 자극제로서 PMA 및 아이오노마이신은 세포의 기능을 보장하기 위한 양성 대조군으로 사용됩니다.
- 플레이트를 37 °C의 5 % CO2 인큐베이터에 놓습니다.
- 선택 사항: 유세포 분석을 사용한 표현형 분석을 위해 여분의 세포를 사용하거나 향후 mRNA 발현 분석을 위해 RNA 안정화 용액에 저장합니다.
8. 말라리아 면역 반응 검출
참고: 최대 4일 동안 공동 배양 실험을 수행합니다. 이 기간 동안에는 중간 변경이 필요하지 않습니다. 최적의 시점은 관심 있는 세포 유형과 질문에 따라 달라집니다. PfRBC에 대한 단핵구 반응은 12-48시간의 배양이 최적인 반면, 림프구 반응은 72-96시간에서 가장 잘 관찰되었습니다. 시점은 실험적 질문을 기반으로 최적화해야 합니다. 온전한 PfRBC와 PBMC 간의 상호 작용에 관심이 있는 경우 더 짧은 기간(2-4시간)을 사용할 수 있습니다.
- 300 x g에서 3분 동안 플레이트를 펠릿 세포로 돌립니다. 각 웰에서 700μl의 배양 상등액을 수집합니다.
- 상층액을 1,000 x g에서 5분 동안 돌려 이물질을 제거합니다.
- 분취량은 필요에 따라 상층액을 제거하고, 라벨을 부착하고, 분비 인자 분석이 수행될 때까지 -20 °C 미만에서 동결합니다.
