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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. GvHD 유도
- Day 0: 수혜자 마우스의 전신 조사
- 생후 10주 이상인 암컷 CD45.2+ H2kd+ BALB/c 마우스를 수혜자로 사용합니다.
- GvHD 유도 전에 수용 마우스의 무게를 측정하고 기록합니다.
메모: 수혜자의 체중이 20g의 최소 체중인지 확인하십시오. 시작 체중은 GvHD 유도 및 진행 과정에서 개별 마우스의 체중 감소를 계산하기 위한 참조 값으로 사용됩니다.
- X선 조사기의 용기에 최대 5마리의 마우스를 놓습니다.
- 전신 조사로 마우스에 8Gy의 X-ray를 1회 조사합니다. Cs137을 방사선 소스로 사용하십시오.
- 1일차: T-세포가 고갈된 골수를 조사한 마우스의 재구성
메모: 동종 골수 세포의 이식은 섹션 1.2에 요약되고 자세히 설명된 바와 같이 방사선 조사 후 24시간 이내에 이루어져야 합니다. 멸균 조직 배양 후드에서 아래 설명된 절차를 수행하고 여과된 시약을 사용합니다. 동종 CD45.1/Ly5.1 B6을 사용합니다. SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl 마우스를 T 세포 고갈 골수 기증자로 사용합니다.
- CD45.1/Ly5.1 B6을 안락사시킵니다. 기관 지침에 따라 동종 골수 세포를 기증할 SJL 마우스, 수혜자 BALB/c 마우스의 방사선 조사 후 12-24시간. 이를 위해 CD45.1/Ly5.1 B6을 마취합니다. 5% 이소플루란 흡입에 의한 SJL 마우스. 호흡 정지 후 1분 이상 이소플루란 노출을 계속하고 경추 탈구에 의한 안락사를 확인합니다.
- 쥐의 털과 피부를 70% 에탄올로 철저히 소독하십시오.
- 마우스를 깨끗한 작업 덮개 위에 놓아 마우스가 뒷다리가 실험자를 향하도록 엎드린 자세를 취하도록 합니다. 길이 13cm의 셈켄 집게 끝과 톱니 모양의 곡선 팁으로 아킬레스 건에서 털을 들어 올립니다. 집게와 발뒤꿈치 사이의 피부를 끝이 곧은 굳어진 8.5cm의 가위로 절개합니다.
- 절개 부위를 두개골로 늘립니다(즉, 발뒤꿈치에서 다리 아래쪽과 허벅지에서 엉덩이 부위까지). 집게를 사용하여 뒷다리의 피부와 털을 제거합니다.
- 다른 뒷다리에도 동일한 절차를 수행합니다.
- 인접한 고관절을 잘라 뒷다리를 제거합니다.
- 뒷발을 잘라냅니다. 무릎 관절을 자릅니다. 모든 뒷다리의 허벅지와 정강이를 얼음 위에 인산염 완충 식염수(PBS)를 채운 92mm 페트리 접시에 함께 보관하십시오.
- 모든 허벅지와 생크에서 가능한 한 많은 근육 조직을 제거하여 대퇴골과 경골 뼈를 조심스럽게 청소하십시오. 멸균 RPMI 1640 배지로 채워진 50mL 튜브에 대퇴골과 경골 뼈를 옮기고 1.2.7단계에서 수집한 모든 경골 및 대퇴골이 근육 조직에서 세척될 때까지 젖은 얼음 위에 놓습니다.
- 골수를 분리하려면 50mL 튜브에서 한 번에 하나의 대퇴골 또는 경골(1.2.8단계에서 설명한 대로 세척)을 RPMI 1640 배지로 채워진 페트리 접시(직경 92mm)로 옮깁니다. 골수가 들어 있는 뼈의 구멍에 접근하기 위해 메스로 대퇴골 또는 경골의 끝을 잘라냅니다.
- 5mL의 RPMI 1640 배지가 포함된 50mL 수집 튜브를 준비합니다. RPMI 1640 배지 1ml를 채운 1mL 주사기에 부착된 26G 바늘을 골강에 삽입하고 플런저를 눌러 골수를 골강에서 채취 튜브로 씻어냅니다.
- 뼈가 가볍고 광택이 날 때까지(즉, 골강에 붉은색 골수가 눈에 띄게 없을 때까지) 1.2.10단계를 반복합니다. 빈 뼈를 버립니다.
- 1.2.8단계의 모든 대퇴골 및 경골을 사용하여 1.2.9 - 1.2.11단계를 반복하고 1.2.10단계의 동일한 50mL 채취 튜브에서 회수된 모든 골수 조각을 수집합니다. 1.2.8단계의 모든 뼈가 적절하게 처리될 때까지 수집 튜브를 젖은 얼음 위에 보관하십시오.
- 씻겨지고 부서지기 쉬운 골수 조각을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 새로운 50mL 수집 튜브에 배치된 40μm 메쉬 스크린 세포 스트레이너를 통해 골수 단일 세포 현탁액을 여과합니다.
- 골수 단세포 현탁액이 들어 있는 50mL 채취 튜브를 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 폐기합니다.
- 적혈구 용해를 위해 5mL의 ACK 용해 완충액(1mM Na2EDTA; 10mM KHCO3; 144mM NH4Cl; pH 7.2)에 펠릿을 재현탁합니다. 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 배양합니다. 그 후, 즉시 10mL의 PBS 용액을 세포 현탁액에 첨가합니다.
- 현탁액을 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 PBS 용액 2mL에 세포를 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 골수 세포를 계수합니다. 세포 정제 후 세포의 순도를 확인하기 위한 유세포 분석을 위해 6 x 106 세포의 부분 표본을 보존합니다(1.2.20 단계 참조).
- 골수 단세포 현탁액에서 T 세포를 고갈시키려면 시중에서 판매되는 세포 정제 키트를 사용하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 전체 골수 세포에서 CD90.2+ 세포(즉, 림프구)를 자기적으로 고갈시킵니다.
- 혈구계를 사용하여 1.2.18단계에서 설명한 대로 분리된 T 세포가 고갈된 골수 세포를 계산합니다. 1.2.20.
단계에 설명된 대로 나중에 유세포 분석을 수행할 수 있도록 1 x 106 세포의 부분 표본을 보존합니다.
메모: 한 명의 기증자 마우스에서 파생된 평균 세포 수율은 일반적으로 2 x 107에서 3.4 x 107 T 세포가 고갈된 골수 세포입니다.
- 유세포 분석으로 성공적인 T 세포 고갈을 확인합니다. 1.2.17단계(자세포 분리 전 골수 세포) 및 1.2.19단계(자기 세포 분리 후 T 세포 고갈된 골수 세포)에서 보존된 1 x10 6 세포를 α-CD45.1(A20), α-CD3(17A2), α-CD4(GK1.5) 및 α-CD8α(53-6.7) 항체로 염색합니다. 1.2.17단계의 나머지 세포를 염색되지 않은 대조군으로 사용하고 단일 염색 대조군으로 사용하여 유세포분석기를 설정합니다.
- 각 샘플의 1 x 106 세포를 V-바닥이 있는 96웰 플레이트의 웰로 옮겨 유세포 분석 염색 절차를 수행합니다.
- 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 96웰 플레이트(단계 1.2.20.1) 내의 세포를 스핀다운합니다.상등액을 버리고 100μL의 FACS 완충액(PBS에 3% 여과된 소 혈청이 보충됨)에 세포를 재현탁합니다.
- 96웰 플레이트 내의 세포를 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상등액을 폐기합니다.
- 100μL의 FACS 완충액에서 단일 염색을 위해 샘플에 적절한 양의 항체를 추가합니다(단계 1.2.20과 비교).
- 자기 T 세포 고갈 이전(1.2.17 단계 참조) 및 후(1.2.19 단계 참조)로부터 보존된 골수 세포 분취액을 별도로 염색하기에 충분한 적절한 양을 함유한 모든 항체의 혼합물(마스터 믹스)을 준비합니다. 마스터 믹스 100μL를 두 부분 표본에 추가합니다.
- 염색되지 않은 샘플에 100μL의 FACS 완충액만 추가합니다.
- 96-well plate 내의 세포를 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 100μL의 FACS 완충액을 추가하고 4°C에서 5분 동안 450 x g의 96웰 플레이트 내의 세포를 원심분리합니다.상등액을 버리고 100μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
- 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.상층액을 버리고 250μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
- 샘플을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기고 세포 샘플을 특성화하는 데 사용된 항체를 라벨링하는 데 사용된 형광 분자를 검출할 수 있는 유세포 분석기 기기로 분석합니다(1.2.20 단계 참조).
- 자기 세포 분리 전후의 세포 구성을 비교합니다.
메모: 일반적으로 라이브 게이트 내에서 약 95%의 CD45.1+CD3-(즉, T 세포 고갈된 골수) 세포의 순도가 달성됩니다.
- T 세포가 고갈된 골수 세포 현탁액을 PBS 용액(4°C에서 5분 동안 450 x g)으로 2배 세척한 다음 마지막으로 PBS 용액에 세포를 재현탁하여 세포 농도를 5 x 107 cells/mL로 조정합니다. 주사할 때까지 세포를 젖은 얼음 위에 보관하십시오.
- T 세포가 고갈된 골수 세포를 전날 방사선 조사를 받은 수용 마우스에 주입합니다(섹션 1.1 참조).
- 실험용 마우스를 누출 방지 챔버에 넣고 마우스가 의식을 잃을 때까지 최대 4%의 이소플루란을 흡입하여 마취를 유도합니다. 오른쪽 반사 작용의 상실과 그에 따른 페달 철수 반사의 상실을 검사하여 진통 및 의식 상실을 확인하십시오.
- PBS 용액을 함유한 5 x 106 T 세포 고갈 골수 세포(즉, 5x107 cells/mL 중 100 μL)를 30G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 정맥동이 포함된 후구근 공간에 주입합니다.
- 2일차: T세포 이식
메모: 멸균 조직 배양 후드에서 아래 설명된 절차를 수행하고 여과된 시약을 사용합니다. CD45.2 C57Bl/6 (야생형; WT) 마우스를 동종반응성 T 세포에 대한 공여자로 사용합니다. 선천성 마커 시스템을 사용하면 수용자(CD45.2+ H2kd+ Balb/c 마우스)와 기증자 조혈 세포 유형(골수 세포: CD45.1+ H2kb+ B6)을 구별할 수 있습니다. SJL 마우스; 동종 T 세포: CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 마우스).
- 적용 기관 지침 및 권한에 따라 C57Bl/6 마우스를 안락사시킵니다. 따라서 5% 이소플루란 농도의 마우스를 흡입하여 마취합니다. 호흡 정지 후 1분까지 이소플루란 노출을 계속하고 자궁경부 탈구에 의한 안락사를 확인합니다. 쥐의 털과 피부를 70% 에탄올로 철저히 소독하십시오.
- 40μm 메쉬 스크린이 있는 스트레이너를 50mL 수집 튜브에 놓습니다. 비장을 제거하고 여과기에 올려 놓습니다.
- 주사기 플런저를 사용하여 여과기의 비장을 분쇄합니다. 스트레이너와 주사기 플런저를 PBS로 세척하여 모든 비장 세포를 수집합니다.
- 50mL 수집 튜브 내의 세포를 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 폐기합니다.
- 적혈구를 용해하기 위해 3mL의 ACK 용해 완충액에 비장 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액을 3분 동안 배양합니다. 그 후, PBS 10mL를 첨가하고 450 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 PBS에 비장 세포를 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 비장 세포를 세십시오. 유세포 분석을 위해 6 x 106 세포의 부분 표본을 전환하여 1.3.9단계에서 정제 규모를 평가합니다.
- 전체 비장세포에서 CD3+ T 세포를 완전히 분리하려면 시중에서 판매되는 세포 정제 키트를 사용하십시오. 제조업체의 프로토콜에 따라 비장 T 세포를 분리합니다.
- 혈구계를 사용하여 1.3.7단계에서 설명한 대로 분리된 비장 CD3+ T 세포를 계수합니다. 유세포 분석을 위해 1 x 106 T 세포의 부분 표본을 보존합니다.
메모: 자기 세포 분리에 의해 분리된 기증자 마우스 당 비장 T 세포의 평균 수율은 1.3 x 107 세포에서 2 x 107 세포 범위입니다.
- 유세포 분석으로 T-cell 분리의 성공 여부를 확인합니다. 염색 프로토콜에 대한 자세한 설명은 1.2.20.1 - 1.2.20.10 단계를 참조하고 따르십시오.
- 1.3.6단계(자성세포 분리 전) 및 1.3.8단계(자성세포 분리 후)의 1 x 106개 비장세포를 α-CD45.2(104), α-CD3(17A2), α-CD4(GK1.5) 및 α-CD8α(53-6.7) 항체로 염색합니다.
- 1.3.6단계의 나머지 세포를 염색되지 않은 대조군으로 사용하고 각 항체로 단일 염색하여 유세포분석기를 설정합니다.
- 자기 세포 분리 전과 후의 세포 구성을 비교합니다.
메모: 림프구 라이브 게이트 내에서 CD45.2+CD3+ T 세포의 순도가 ≥95%가 되어야 합니다.
- T 세포를 PBS로 2x(4°C에서 5분 동안 450 x g)로 세척한 다음 마지막으로 PBS 용액에 세포를 재현탁하여 세포 농도를 7 x 106 cells/mL로 조정합니다. 주사할 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 이전에 CD45.1+ T 세포가 고갈된 골수 세포를 투여받은 방사선 조사된 BALB/c 마우스에 동종 반응성 비장 T 세포(1.3.10 단계 참조)를 주입합니다(1.2.22 단계 참조).
- 실험용 쥐를 누출 방지 챔버에 넣어 의식을 잃을 때까지 최대 4%의 이소플루란에 노출시켜 마취를 유도합니다. 오른쪽 반사 작용의 상실과 그에 따른 페달 철수 반사의 상실을 검사하여 진통 및 의식 상실을 확인하십시오.
- PBS 용액(1.3.10 단계 참조)이 포함된 30G 바늘(즉, 7 x 106 세포/mL 100μL)이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 0.7 x 106 동종반응성 CD3+ T 세포를 마우스의 retrobulbar 공간에 정맥 주사하여 GvHD를 유도합니다.이 마우스를 실험 그룹으로 명명합니다.
- 100μL의 PBS만 있는 다른 그룹의 마우스를 retrobulbar 공간에 정맥 주사하고 이 그룹을 대조군으로 명명하여 나중에 "no-T-cell-transplanted(noT) 마우스"라고 합니다.