미세주입을 통해 장 오가노이드에서 기생충 감염을 일으키는 기술

초록

출처: Dutta, D., et al. 미세 주입에 의한 3D 조직 유래 인간 오가노이드 배양 시스템에서 크립토스포리듐 감염 연구. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 인간 장 오가노이드 감염 모델을 개발하기 위한 미세 주입 기술을 보여줍니다. 기생충 크립토스포리디움 파르붐(Cryptosporidium parvum)의 감염성 포자암(sporozoite) 단계는 오가노이드 내강(lung)에 미세주입됩니다. 오가노이드의 상피 세포에 침입하면 무성 생식과 유성 생식을 거쳐 생명 주기를 완료하고 감염을 퍼뜨립니다.

프로토콜

1. C. parvum Oocysts에서 포자물의 체외 정제

1. 위에서 설명한 대로 표백하고 표백제를 씻어낸 후 C. parvum oocysts에서 포자낭을 정제합니다.
   1. 난포낭을 15mL 튜브로 옮깁니다. 난포낭을 실온 excystation medium(DMEM에서 0.75% w/v sodium taurocholate)에 재현탁시켜 1 x 10⁷ 난포낭/mL를 얻습니다. 타우로콜레이트를 첨가하면 난포낭의 배설률이 향상되어 포자낭 수율이 향상됩니다.
   2. 37°C에서 1–1.5시간 동안 난낭 현탁액을 배양합니다.
   3. excystation의 정도를 위해 현미경으로 견본을 검사하십시오; 60-80% excystation는 sporozoites의 좋은 회복을 위해 적당합니다. excystation 수준이 낮으면 더 오래 배양하십시오 (30 분에서 1 시간 더 배양).
   4. 시작 난포낭의 수에 상대적인 excyation 백분율을 결정합니다. Excystation은 다음과 같이 계산됩니다.
      % excystation = [1 – (온전한 난포낭 수/시작 시 난포낭 수)] x 100
   5. 14mL의 PBS 또는 배지를 첨가하여 세포(온전한 난포낭, 난포낭 껍질 및 포자낭물)를 3,400 x g에서 20분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고 배설물 시약을 제거하기 위해 세포를 세척합니다. 세포가 손실되지 않도록 조심스럽게 흡인하십시오.
   6. DMEM 1–2mL에 스포로조이트 펠릿을 재현탁하여 3 x 10⁷ 난포낭/mL를 얻습니다(시작 난포낭 수 기준).
   7. 남아 있는 난포낭과 껍질을 제거하려면 3μm 필터를 통해 현탁액을 여과합니다(그림 1B). 10mL 주사기 배럴에 부착된 폴리카보네이트 필터(3μm 공극 크기)가 장착된 47mm 필터 홀더 장치를 사용합니다. 필터 홀더 장치를 15mL 튜브 위에 놓습니다. 어셈블리를 얼음 양동이나 차가운 방에 넣으십시오.
   8. 7.5mL의 스포로조이트 현탁액을 필터 어셈블리에 추가하고 중력에 의해 여과되도록 합니다. 다른 7.5mL의 DMEM.
      으로 세척합니다. 메모: 포자암 분리의 성공을 위해서는 신선한 난포낭과 우수한 excystation이 중요합니다. excysted 난포낭이 너무 많으면 서스펜션이 중력에 의해 흐르지 않습니다. 주사기에 압력을 가하면 excysted 난포낭이 통과할 수 있습니다. 포자낭의 미세주입은 난포자낭보다 더 까다로운데, 그 이유는 포자낭이 뭉쳐서 모세혈관을 막을 수 있기 때문입니다. 이를 방지하려면 오가노이드에 포자충을 주입할 때 더 넓은 모세관 팁을 만드는 것이 좋습니다. 충분한 수준의 감염을 달성하려면 난포낭에 감염된 오가노이드에 비해 2-4배의 포자물을 각 오가노이드에 주입해야 합니다.
   9. 스윙 버킷 로터를 사용하여 3,400 x g에서 여과된 스포로조이트 현탁액을 20분 동안 펠릿으로 원심분리합니다.
   10. 0.05%(w/v) 패스트 그린 염료 및 L-글루타티온, 베타인, L-시스테인, 리놀레산 및 타우린 함유 환원 완충액이 보충된 50–100μL의 OME 또는 OMD 오가노이드 배양 배지(재료 표 참조)에 재현탁합니다(재료 표 참조).
       메모: 난포낭을 너무 오래 배양하면 포자낭이 용해되고 회복이 잘 되지 않을 수 있으므로 피해야 합니다.

2. 미세주입을 위한 인체 장의 체외 배양

1. 확장 및 분화 배지 조건에서 배양 장 오가노이드.
   참고: 장 증식에 대한 자세한 내용은 이전에 다른 기사에서 설명했습니다(배지 레시피는 재료 표 참조). 여기에서는 크립토스포리듐 주입 및 성장을 위한 최적화에 대한 구체적인 참조와 함께 오가노이드 배양 방법을 간략하게 설명합니다. 우리는 오가노이드에서 기생충을 이미징하기 위해 분화 배지에서 성장한 오가노이드가 분화 배지에서 성장한 오가노이드보다 파편 축적이 적기 때문에 분화 배지에서 성장한 오가노이드보다 선호된다는 것을 발견했습니다. 그러나 목표가 난포낭을 분리하는 것이라면 분화 배지에서 성장한 오가노이드는 훨씬 더 많은 수의 난포낭을 생성합니다.
   1. 37°C에서 세포외 기질(재료 표 참조)의 3D 배양에서 오가노이드를 유지합니다. 그 위에 OME(오가노이드 확장 배지)를 추가하고 매일 새로 고칩니다.
   2. 미세주입을 위해 오가노이드를 분리하고 플레이트링하려면 인간 오가노이드가 포함된 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고 웰에 F12+++(재료 표 참조)를 추가한 다음 1mL 피펫 팁으로 여러 번 피펫팅하여 매트릭스를 분해합니다. 15mL 튜브에 세포를 수집합니다(튜브당 F12+++ 2mL이면 추가 절차에 충분).
   3. F12+++ 10-12mL를 다른 15mL 튜브에 넣고 화염 광택 유리 피펫을 배지에 넣고 위아래로 3회 피펫을 사용하여 인간 장 오가노이드를 분해합니다.
      메모: 긴 유리 피펫(20-30cm)을 사용하여 짧게 불광택을 냅니다. 오가노이드가 손상될 수 있으므로 개구부(직경 1mm)를 너무 작게 만들지 마십시오. 피펫 끝을 짧게 불로 연마하여 매끄럽게 만듭니다. 오가노이드를 ~50μm의 더 작은 조각으로 나눕니다.
   4. F12+++를 최대 5–7mL까지 첨가하고 350 x g에서 5분 동안 원심분리
      메모: 이 단계의 원심분리 속도는 세포외 기질과 잘 분리된 우수한 세포 펠릿을 만들기 위해 정상보다 빠릅니다(재료 표 참조). 우리는 쥐 소장 오가노이드와 비교했을 때, 인간 소장 오가노이드가 파괴하기가 더 어렵다는 것을 관찰했습니다.
   5. 세포를 방해하지 않고 가능한 한 많은 매체를 제거한 다음 매트릭스를 4°C로 유지한 상태로 펠릿을 재현탁합니다. 6웰 플레이트의 웰당 200–300μL의 매트릭스가 필요합니다. 오가노이드는 상당히 높은 세포 밀도를 유지하기 위해 3개로 분할되어야 합니다.
   6. 오가노이드를 6웰 플레이트의 웰에 각각 약 5–10 μL의 매트릭스 방울로 플레이트화합니다. 37 °C에서 20-30 분 동안 배양 한 다음 그 위에 팽창 배지 (OME)를 추가합니다.
   7. 2-3일마다 매체를 변경합니다.
      메모: 약 5-7일 후에 EM에서 성장하는 오가노이드는 100-200μm 크기에 도달하고 주입 준비가 완료됩니다.
   8. 오가노이드를 구별하기 위해 EM에서 5-6일 후에 배지를 분화 배지(DM) 조건으로 변경하고 기생충을 주입하기 전에 추가로 5-6일 동안 보관합니다.
      메모: 오가노이드의 팽창을 위해서는 오가노이드를 조밀하게 플레이트하는 것이 좋습니다. 미세주입의 경우, 더 낮은 밀도로 도금된 오가노이드와 함께 6웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 6웰 플레이트의 3웰에서 오가노이드를 미세 주입을 위한 전체 6웰 플레이트로 플레이트화할 수 있습니다. 매트릭스는 장기 보관을 위해 -20°C에서 유지해야 하며 사용하기 전에 4°C 또는 얼음에서 해동해야 합니다.

3. Organoid Lumen에 난포낭/포자낭의 미세 주입

1. 3D 오가노이드의 정점 쪽에 기생충을 미세주입합니다(그림 2).
   1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 직경 1mm의 유리 모세관을 준비합니다.
      메모: 마이크로피펫 풀러(재료 표 참조)에 사용되는 설정은 Heat = 663, Pull = 100, Velocity = 200, Time = 40 ms입니다. 특정 기계에 대한 사용자 지침에 따라 설정을 조정해야 합니다.
   2. 집게로 모세관 끝을 자릅니다. 모세관 끝단의 크기/직경은 약 9-12μm를 측정합니다. 이를 통해 난포낭(4–5μm 크기)이 쉽게 흐를 수 있습니다.
   3. 마이크로 로더 팁을 사용하여 모세관을 난낭 또는 스포로조이트 현탁액으로 채웁니다.
   4. 난포낭으로 채워진 모세혈관을 마이크로인젝터에 로드합니다.
   5. 100–200 nL 현탁액을 5배 배율의 도립 현미경으로 각 오가노이드에 미세주입하여 압력을 일정하게 유지합니다. 미세주입 후 매일 OME 또는 OMD(오가노이드 분화 배지)로 배지를 새로 고치고 플레이트를 37°C.
      로 유지합니다. 메모: 우리는 미세 주입을 위해 미세 매니퓰레이터를 사용하지 않습니다. 모든 샘플에서 동일한 주입을 보장하기 위해 전체 실험에 동일한 모세관을 사용하는 것이 좋습니다.

결과

그림 1: 크립토스포리디움 난포낭(Cryptosporidium oocysts) 및 포자낭(sporozoites)의 준비 및 정제. (A) 감염을 위한 난포낭 및 포자암 제조에 사용되는 방법의 개략도. (B) 난포낭의 체외 발설을 보여주는 이미지. unexcysted oocysts 및 껍질을 여과하면 sporozoites의 정제 된 용액을 얻을 수 있습니다. 눈금 막대 = 10μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
기저막 추출물 (extracellular matrix)	(주)암스바이오	전화: 3533-010-02
Dynamag 15 랙	써모피셔 사이언티픽	12301디
Dynamag 2 랙	써모피셔 사이언티픽	12321디
EMD Millipore Isopore 폴리카보네이트 멤브레인 필터 - 3μm	EMD-밀리포어	TSTP02500
빠른 녹색 염료	시그마	F7252-5G
Femtojet 4i 마이크로인젝터	에펜도르프	5252000013
직경 1mm의 유리 모세관	WPI (영어)	TW100F-4
마트리겔(세포외 기질)	코 닝	356237
마이크로 배기 튜브 1.5ml	에펜도르프	T9661-1000개
마이크로 로더 팁	에펜도르프	전화: 612-7933
마이크로 피펫 풀러 P-97	셔터 계기	P-97
펜스트렙	지브코	15140-122
하이포클로라이트나트륨(5% 사용)	클로록스	50371478
슈퍼 스틱 슬라이드	수성, Inc	시즌 100-3
Swinnex-25 47mm 폴리카보네이트 필터 홀더	EMD-밀리포어	SX0002500
타우로콜산, 나트륨 소금 수화물	시그마	T4009-5G
트윈-20	머 크	8221840500
소용돌이 지니 2	과학 산업, Inc	SI0236
어드밴스+++ (DMEM+펜스트렙+글루타맥스+헤페스)			최종 금액
DMEM을 참조하십시오.	인비트로젠	제12634-010	500ml
펜스트렙	지브코	15140-122	500ml DMEM에 5ml의 육수
글루타맥스	지브코	35050038	500ml DMEM에 5ml의 육수
헤페스	지브코	15630056	500ml DMEM에 5ml의 육수
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (팽창 배지)			최종 집중
대답83-01	토크리스	2939-50mg	0.5μm
어드밴스+++			100ml까지 만들기
나27	인비트로젠	17504044	1배
증권 시세	페프로텍	AF-100-15	50ng/mL
가스트린	토크리스	3006-1mg	10nM
NAC (나치)	시그마	A9125-25G	1.25분 중
NIC	시그마	N0636-100지	10미디엄
노긴 CM	사내*		10%
P38 억제제 (SB202190)	시그마	S7076-25 밀리그램	10μm의
PGE2	토크리스	2296-10	10nM
프리모신	인비보젠	개미-PM-1	1ml/500ml 미디어
RSpoI CM	사내*		20%
Wnt3a CM	사내*		50%
사내* - 요청 시 세포주가 제공됩니다.
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (분화 배지)			오가노이드를 분화하기 위해 분열 후 6-7일 동안 Wnt가 풍부한 배지에서 팽창하는 소장 오가노이드를 성장시킨 다음 분화 배지(Wnt, 니코틴아미드 SB202190 철회), 분화 배지(Wnt가 풍부한 배지 또는 OME에서 Wnt, 니코틴아미드, SB202190, 프로스타글란딘 E2 철회)에서 성장시켰습니다.
완충액 감소(주사를 위한 난포낭 및 포자낭의 재현탁용)			최종 집중
L-글루타티온 감소	시그마	G4251-10MG	0.5μg/μl의 OME/OMD/LOM
베타인	시그마	61962	0.5μg/μl의 OME/OMD/LOM
L-시스테인	시그마	168149-2.5지	0.5μg/μl의 OME/OMD/LOM
리놀레산	시그마	L1376-10MG	6.8 μg/ml의 OME/OMD/LOM
황소자리	시그마	T0625-10MG	0.5μg/μl의 OME/OMD/LOM

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