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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 감염
- Anopheles stephensi 모기를 gametocytemic 마우스에 15분 동안 먹이를 주어 Plasmodium berghei ANKA에 감염시킵니다. 감염된 모기를 습도 80%, 21°C에서 유지하십시오.
- 혈액 식사 후 17일에서 22일 후에 우리에서 암컷 모기를 수집합니다. 얼음 위에 올려 마취시킵니다.
- 집게를 사용하여 차가운 RPMI 배지 한 방울로 덮인 유리 슬라이드에 3-4 마리의 모기를 놓습니다. 슬라이드를 현미경 아래에 놓습니다.
- 집게를 사용하여 머리와 몸통 사이에 모기를 조심스럽게 펴십시오. 주사기와 바늘을 사용하여 침샘을 분리합니다. 나머지 모기에 대해 이 절차를 반복합니다.
- 유리 슬라이드에서 타액선을 유리 피펫으로 빨아들여 1.5mL 원심분리 튜브에 넣어 모읍니다.
메모: 감염률에 따라 일반적으로 타액선당 8,000에서 15,000개의 전염성 포자암을 얻을 수 있습니다.
- 약 3분 동안 작은 플라스틱 막대기로 원심분리기 튜브 내에 분리된 타액선을 부수어 타액선 조직에서 포자낭을 분리합니다.
- 1,000 x g 및 4°C에서 3분 동안 원심분리기를 사용하여 나머지 조직에서 포자충을 정제합니다.
- 포자암(SPZ)을 포함하는 상등액을 새 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 Neubauer 혈구계에서 정제된 포자암을 계수합니다.
- 인산염 완충 식염수를 첨가하여 정제된 포자암의 농도를 10,000/mL로 조정합니다.
- 총 1,000개의 스포로조산물(0.1mL)을 근친 C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 주입하여 감염을 시작합니다. 주사를 용이하게 하기 위해 C57BL/6 마우스를 구속기에 넣고 꼬리를 따뜻한(약 37°C) 물에 넣어 꼬리 정맥을 시각화하는 데 도움을 줍니다.
메모: 주사 자체는 몇 초 안에 수행할 수 있는 짧은 절차입니다.
- 하루에 한 번, SPZ 감염 후 3일째부터 혈액 도말에서 혈액 단계 기생충혈증을 확인합니다.
- 포자석 주입 후 5일째부터 RMCBS(Rapid Murine Coma and Behavior Scale) 점수로 하루에 한 번 마우스를 평가합니다.
- RMCBS(Rapid Murine Coma and Behavior Scale) 점수와 해결해야 할 연구 질문에 따라 MRI(자기 공명 영상) 영상으로 생쥐를 평가합니다.