Visualization of Extracellular Traps in Macrophages from Human Bronchoalveolar Lavage Fluids

Abstract

출처: Sharma, R. et al., 컨포칼 현미경을 사용하여 대식세포 외 트랩 시각화. J. Vis. 특급 (2017)

이 동영상은 기관지폐포 세척액에서 기관지폐포 대식세포의 대식세포 외 트랩(METs)의 면역 라벨링과 컨포칼 현미경을 사용한 시각화를 보여줍니다.

Protocol

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 기관지폐포 세척 (BAL) 대식 세포

1. BAL을 사용하여 (1) 기관지 내시경 검사를 통한 인간 피험자 및 (2) 기관 내 흡인을 사용하여 마우스에서 폐 대식세포를 얻습니다.
   메모: 대식세포의 획득은 일반적으로 이러한 세포의 일부 활성화를 유발합니다. 대식세포는 잠재적인 의학적 문제를 조사하기 위해 기관지 내시경 검사가 필요한 환자로부터 얻어지며 모든 피험자가 대식세포 외 트랩(METs) 분석에 적합하지 않을 수 있습니다(이는 각 개별 프로젝트에 대해 결정해야 함).
   1. BAL 용액을 사용하여 펠릿을 형성하기 위해 (500 x g에서 10 분) 펠렛을 형성하고 실온에서 배양 배지 (5 % 태아 송아지 혈청 및 1 % L-글루타민이 함유 된 RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium))로 2 회 세척 한 다음 4mL의 배양 배지에 세포를 희석합니다.
   2. 필요한 경우 공식적인 감별 계수를 요청하십시오. 대부분의 세포(일반적으로 >80%)는 대식세포가 됩니다.
      메모: 이것은 일반적으로 다양한 세포 유형의 형태학적 모양을 사용하는 임상 조직학 서비스에 의해 수행됩니다.
   3. Trypan blue exclusion 및 hemocytometer를 사용하여 BAL 용액에서 생존 가능한 대식세포 세포 수를 수행합니다.
      메모: BAL 용액은 1.1단계에서 언급한 바와 같이 인간과 마우스에서 얻습니다.
   4. 웰당 500μL의 배양 배지에 있는 커버슬립의 24웰 플레이트에 1 - 4 x 10⁵ 대식세포를 추가하고 37°C에서 하룻밤 동안 방치합니다. 세포는 커버슬립에 부착됩니다. 인체 샘플의 경우 박테리아 오염을 방지하기 위해 항생제(예: 페니실린 및 스트렙토마이신, 10⁴ U/mL)를 추가합니다.

2. BAL 대식세포의 면역형광 라벨링/현미경

검사

참고: 셀은 위에서 언급한 바와 같이 커버슬립에 부착됩니다.

1. 배양 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 세척합니다. 2% 파라포름알데히드/오디에이트/라이신(PLP) 고정제에 10분 동안 세포를 고정합니다.
2. PBS에서 세포를 잠시 세척한 다음 PBS에서 0.2% Tween 20에서 20분 동안 투과화합니다.
3. PBS에서 30분 동안 희석된 5% 소 혈청 알부민(BSA)에 10% 닭 혈청이 있는 세포를 차단합니다.
4. 37 °C에서 1:100 농도(자세한 내용은 재료 표에 나와 있음)로 실온에서 1시간 동안 1차 및 동형 대조 항체로 배양합니다<> 메모: BAL 샘플의 경우 일반적으로 대식세포의 특정 마커가 필요하지 않습니다.
5. 1차 항체를 첨가한 후 PBS에서 세포를 세척하고 해당 2차 항체를 실온에서 40분 동안 추가로 배양합니다.
6. PBS에서 절편을 세척하고 DAPI 기반 장착 매체로 장착하여 레이저 여기 405, 488, 561 및 647 nm와 40X, 1.0 NA 오일 대물렌즈에서 컨포칼 현미경(위에서 언급)을 사용하여 시각화합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인간 샘플: 1차 항체
토끼 안티 휴먼 H3Cit (시트룰린 R26)	아브캠	AB5103	10ug/ml
마우스 안티 휴먼 MMP9	Novus 생물학	AB119906	1:200 복수, 집중 없음
토끼 안티 휴먼 PADI2 / PAD2	아브캠	AB16478	7 ug / 밀리람베르트
마우스 안티 휴먼 PADI4 / PAD4	아브캠	AB128086	10.1 ug / ml
2차 항체
치킨 안티 래빗 AF 488/	생명 기술	A-21441
닭 안티 토끼 AF 594	생명 기술	A-21442
닭 안티 염소 AF 594	생명 기술	A-21468
치킨 안티 마우스 AF488	생명 기술	A-21200
소프트웨어 프로그램
이마리스	비트플레인
이미지 J	국립보건원(NIH)
형광의 평균 강도를 위해 Microsoft Excel과 같은 표준 사무용 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다
현미경
C1 컨포칼 주사 현미경	니콘
FV1200 컨포칼 주사 현미경	올림푸스
Monash Medical Center의 기관지 내시경 검사실에서 채취한 인간 BAL 시료
미디어
RPMI	시그마-알드리치	R8758
태아 송아지 세럼	시그마-알드리치	F0926
L-글루타민	시그마-알드리치	G7513
다른 시약
파라포름알데히드/주기산염/라이신(PLP) 고정제	시그마-알드리치	27387
천연 포르말린	시그마-알드리치	42904
커버 슬립 12ml	시그마-알드리치	S1815
커버 슬립 60 x 24 ml	시그마-알드리치	C6875