벼 식물 잎에 곰팡이 감염을 일으키기 위한 스프레이 접종 기술

초록

출처: Zhang, M., et al. 식물 감염 검사: 식물 병원균 Magnaporthe Grisea를 사용한 스프레이 및 상처 매개 접종. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 벼 식물 잎에서 병원성 곰팡이 Magnaporthe grisea 감염을 확립하는 기술을 보여줍니다. 곰팡이 분생포자 현탁액을 벼 잎의 일부에 살포하고 괴사성 병변의 형성을 점수화하여 질병 진행을 평가합니다.

프로토콜

1. M. grisea Conidia의 현탁액을 사용한 스프레이 접종

1. M.grisea의 곰팡이 문화
   1. 곰팡이 균주에 대한 오트밀 토마토 한천(OTA) 배양 배지를 준비합니다.
   2. 오트밀 30 - 50 g의 무게를 달아 800 mL의 증류수/탈이온수(ddH₂O)에 넣고 전기 냄비에서 30분 동안 끓입니다.
   3. 삶은 오트밀 주스를 거즈 조각을 통해 비커로 걸러냅니다.
   4. 비이커의 여과액에 토마토 주스 150mL와 한천 20g을 넣고 ddH_2O를 최대 1,000mL까지 첨가합니다.
2. 실험 재료의 준비
   1. 쌀 (Oryza sativa) 품종 Lijiangxintuan-heigu (LTH)의 약 50 씨앗을 ddH₂O에 3 일 동안 담그거나 보리 (Hordeum vulgare, cv, Golden Promise)의 약 50 씨앗을 ddH₂O에 약 1 일 동안 담그십시오.
   2. 쌀이나 보리의 씨앗을 촉촉한 거즈로 싸서 28 °C에서 직경 10cm x 10cm의 페트리 접시 30 개 정도에 촉촉한 여과지에 발아시킵니다. 벼 종자 발아 시간은 약 2 - 3 일, 보리 종자 발아 시간은 약 2 일이다. 온실의 상대 습도는 약 70%입니다.
   3. 벼나 보리의 묘목을 오토클레이브 화분용 흙과 물을 사용하여 화분에 심고 질석 층으로 덮습니다.
   4. 식물을 적절한 온실 또는 25 °C의 성장 캐비닛에 약 1 ~ 2 주 동안 놓습니다.
   5. 멸균 수술용 가위로 여과지 3겹을 원형으로 자르고(각 원의 직경은 8cm여야 함) 100mm 멸균 플라스틱 접시에 놓습니다.
   6. 각 접시에 ddH₂O를 추가하여 여과지를 적십니다.
   7. 여과지가 완전히 젖었는지 확인하되 물을 더 넣지 마십시오.
   8. 진공 펌프로 여분의 물을 제거하십시오.
   9. 쌀/보리 잎을 지지하기 위해 배양 접시에 멸균 이쑤시개 2개를 넣고 이쑤시개를 ~2 - 3cm 간격으로 둡니다.
   10. 씨를 파종한 후 2주 후에 벼잎을 채취하거나 씨를 파종한 후 7일 후에 보리 잎을 채취합니다.
   11. 쌀/보리의 4-6잎 묘목을 사용하여 줄기의 아래쪽 부분을 위에서 ~5cm 떨어진 곳에서 자르고 잎을 수집합니다.
3. 분무 접종 프로토콜
   1. OTA 플레이트의 곰팡이 균주를 자동 온도 조절 인큐베이터(25°C)에서 ~4일 동안 배양합니다.
   2. 0.5 - 5 mL 피펫을 사용하여 각 4일 된 플레이트에 ~2 mL의 ddH₂O를 추가합니다.
   3. 접종 루프를 통해 M. grisea 야생형 균주와 돌연변이 균주의 균사체를 균사체 파편으로 긁어냅니다.
   4. 균사체 파편을 모아 새 OTA 플레이트로 옮깁니다. 균사체 찌꺼기를 제거하고 깨끗한 벤치에서 바람으로 말리십시오.
   5. 낮에는 25 ° C (14 시간), 밤에는 23 ° C (10 시간)에서 24-48 시간 동안 온실에서 분생포자의 성장에 필요한 습도를 보장하기 위해 접시를 3 겹의 거즈로 덮습니다.
   6. 각 접시에 ddH₂O 2mL를 넣고 멸균 면봉으로 분생포자를 부드럽게 긁어낸 다음 2겹의 렌즈 종이를 통해 여과합니다. 배양 배지의 표면이 긁히지 않도록 주의하십시오.
   7. 100 - 1,000 μL 피펫을 사용하여 분생자 현탁액을 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.
   8. 25°C에서 최소 5,000 x g에서 5분 동안 원심분리기
   .
   9. 상등액을 제거하고 펠릿을 재현탁하여 0.025%(v/v) Tween-20 용액에서 mL당 2 x 10⁴ 분생포자를 제공합니다. Tween-20 용액은 일반적으로 약 10 - 20mL입니다.
   10. 포자 현탁액을 휴대용 분무기에 붓습니다.
   11. 2주 된 벼 묘목의 벼 잎 또는 7일 된 보리 묘목의 보리 잎에 약 10mL의 원뿔 현탁액을 중성화하고 어둡고 습한 챔버에서 25°C에서 ~24시간 동안 배양합니다.대조 식물에 0.025%(v/v) Tween-20 용액을 분사합니다.
   12. 잎을 25 ° C의 형광등 아래에서 12 시간의 광주기 동안 다른 습한 챔버로 옮깁니다.
   13. 접종 후 5일째에 질병 증상을 기록한다. 길이가 ~6cm인 병든 쌀/보리 잎을 검사합니다. 평가 기준은 IRRI(International Rice Research Institute)의 폭발 저항에 대한 채점 시스템을 따릅니다. 폭발 저항에 대한 점수 시스템의 세부 사항은 표 1에 나와 있습니다.
   14. 테스트된 균주의 감염을 평가하기 위해 잎 사진을 찍습니다. 감염은 3.6cm당 병변 수로 평가하였다².

표 1: 폭발 저항을 위한 점수 시스템. 이 표는 IRRI(International Rice Research Institute)에서 인용한 것입니다.

개 개 개 감염이 자민 전 개 개

저울	묘사
1	핀 포인트 크기의 작은 갈색 반점
2	작고 둥글거나 약간 길쭉한 괴사성 회색 반점, 직경 약 1-2mm, 뚜렷한 갈색 여백이 있습니다. 병변은 대부분 위쪽 잎에서 발견됩니다
3	병변 유형은 2와 동일하지만 상당한 수의 병변이 위쪽 잎에 있습니다
4	형이며, 3mm 이상으로, 잎 면적의 4% 미만을 감염시킵니다.
5	3mm 이상의 전형적인 감수성 블라스트 병변은 잎 면적의 4-10% 미만을 감염시킵니다.
6	3mm 이상의 전형적인 감수성 폭발 병변은 잎 면적의 11-25% 미만을 감염시킵니다.
7	3mm 이상의 전형적인 감수성 돌파 병변은 잎 면적의 26-50% 미만을 감염시킵니다.
8	전형적인 감수성 폭발 병변은 3mm 이상이며 잎 면적의 51-75% 미만을 감염시키고 많은 잎이 죽습니다.
9	3mm 이상의 전형적인 감수성 돌파 병변은 잎 영역의 75% 이상을 감염시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
한천	AOBOX Biotechnology (중국)	01-023
여과지	GE 헬스케어 브랜드(스웨덴)	10311387
50mL 튜브	코닝(아메리카)	제430290
원심 분리기	에펜도르프(아메르시아)	5804R
트윈-20	Coolaber (중국)	CT11551-100ml
문화 요리	Thermofisher(아메리카)	150326
0.5-5 mL 피펫	에펜도르프	4920000105
100-1000uL 피펫	에펜도르프	4920000083
진공 펌프	레이볼드	D25B
부 화기	메머트	픽스313
접종 링	Greiner 바이오 원	731175

년 호