1. M.grisea의 곰팡이 문화
- 곰팡이 균주에 대한 오트밀 토마토 한천(OTA) 배양 배지를 준비합니다.
- 오트밀 30 - 50 g의 무게를 달아 800 mL의 증류수/탈이온수(ddH2O)에 넣고 전기 냄비에서 30분 동안 끓입니다.
- 삶은 오트밀 주스를 거즈 조각을 통해 비커로 걸러냅니다.
- 비이커의 여과액에 토마토 주스 150mL와 한천 20g을 넣고 ddH2O를 최대 1,000mL까지 첨가합니다.
2. 실험 재료의 준비
- 쌀 (Oryza sativa) 품종 Lijiangxintuan-heigu (LTH)의 약 50 씨앗을 ddH2O에 3 일 동안 담그거나 보리 (Hordeum vulgare, cv, Golden Promise)의 약 50 씨앗을 ddH2O에 약 1 일 동안 담그십시오.
- 쌀이나 보리의 씨앗을 촉촉한 거즈로 싸서 28 °C에서 직경 10cm x 10cm의 페트리 접시 30 개 정도에 촉촉한 여과지에 발아시킵니다. 벼 종자 발아 시간은 약 2 - 3 일, 보리 종자 발아 시간은 약 2 일이다. 온실의 상대 습도는 약 70%입니다.
- 벼나 보리의 묘목을 오토클레이브 화분용 흙과 물을 사용하여 화분에 심고 질석 층으로 덮습니다.
- 식물을 적절한 온실 또는 25 °C의 성장 캐비닛에 약 1 ~ 2 주 동안 놓습니다.
- 멸균 수술용 가위로 여과지 3겹을 원형으로 자르고(각 원의 직경은 8cm여야 함) 100mm 멸균 플라스틱 접시에 놓습니다.
- 각 접시에 ddH2O를 추가하여 여과지를 적십니다.
- 여과지가 완전히 젖었는지 확인하되 물을 더 넣지 마십시오.
- 진공 펌프로 여분의 물을 제거하십시오.
- 쌀/보리 잎을 지지하기 위해 배양 접시에 멸균 이쑤시개 2개를 넣고 이쑤시개를 ~2 - 3cm 간격으로 둡니다.
- 씨를 파종한 후 2주 후에 벼잎을 채취하거나 씨를 파종한 후 7일 후에 보리 잎을 채취합니다.
- 쌀/보리의 4-6잎 묘목을 사용하여 줄기의 아래쪽 부분을 위에서 ~5cm 떨어진 곳에서 자르고 잎을 수집합니다.
3. M. grisea의 균사체 큐브 또는 원추형 현탁액 방울을 사용한 부상 접종
- 해부학적 바늘을 사용하여 분리된 쌀/보리 잎의 주요 정맥에 있는 2 - 3cm 길이의 상처 3개를 긁어냅니다. 잎이 관통하지 않도록 주의하십시오.
- 긁어낸 잎을 이쑤시개에 놓고 잎에 0.02%(v/v) Tween-20 용액을 분사하여 물방울 층을 형성합니다.
- OTA 플레이트에서 각 M. grisea 균주(야생형, 돌연변이, 보체 균주 또는 기타 테스트 균주)에 대해 0.5cm x 0.5cm 균사체 플러그를 자릅니다.
상처 입은 - 잎에 균사체 플러그 또는 25 μL 방울의 원생포자 현탁액을 놓고 25 °C의 습한 챔버에서 3 - 8 일 동안 잎을 배양합니다.
- 접종 후 5 - 7일에서 병변을 검사합니다. 검사 방법은 분무 접종 방법과 동일합니다(1.3.13 단계 참조).
- ~6cm 길이의 병든 쌀/보리 잎을 검사하고 사진을 찍어 테스트된 균주의 감염을 평가합니다. 감염은 3.6cm당 병변 수로 평가하였다2.
