바이러스 감염 검출을 위한 체외 재조합 바이러스 리포터 시스템

초록

출처: Nishitsuji, H., et al. 복제 주기의 초기 단계를 모니터링하기 위한 B형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 재조합 HBV 리포터 시스템을 통해 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 검출하는 체외 기술을 보여줍니다. 숙주 세포를 감염시키면 재조합 바이러스 게놈은 루시퍼라제 리포터 효소를 발현하며, 이 효소는 기질을 산화시킬 때 생물 발광을 생성하여 바이러스 감염을 감지하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 리포터 단백질을 암호화하는 재조합 HBV 생산

1. HepG2 세포의 준비
   1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 비필수 아미노산이 보충된 세포 배양 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium 또는 DMEM)를 준비합니다.
   2. transfection 하루 전에 10cm 콜라겐 코팅 접시에 4 x 10⁶ HepG2 세포를 10ml의 배양 배지에 플레이트화합니다. HepG2 세포를 37°C에서 가습된 5% CO₂ 배양기에서 배양합니다.
      메모: 약 4 x 10⁶ HepG2 세포를 10ml 배양 배지에 10cm 콜라겐 코팅 접시에 넣으면 다음 날 70-90% 융합됩니다.
2. 형질주입(Transfection)
   1. 제조업체의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여 5μg의 pUC1.2HBV(B형 간염 바이러스) 델타 엡실론과 5μg의 pUC1.2HBV/NL15로 HepG2 세포를 transfection합니다.
   2. 다음날, 배양 배지를 제거하고 신선한 배양 배지 10ml를 첨가하십시오.
   3. transfection 1주일 후, 재조합 HBV가 포함된 배양 배지를 50ml 튜브로 옮기고 1.3.1단계로 진행합니다. transfection된 세포가 들어 있는 플레이트에 10ml의 신선한 배양 배지를 추가합니다.
      메모: 재조합 HBV의 생산은 4주 동안 유지됩니다. 재조합 HBV를 함유하는 배양액은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
3. 재조합 HBV의 정제
   1. 원심분리(2,300 x g에서 5분)로 재조합 HBV가 포함된 배양 배지에서 세포 파편을 제거합니다.
   2. 0.45μm 멤브레인 필터를 통해 상층액을 통과시킵니다.
   3. 재조합 HBV를 함유하는 배양 배지에 26% PEG/1.5M NaCl(폴리에틸렌 글리콜 6000: 130g, NaCl, 49g, 0.5M EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) pH 8.0 1ml 및 1M HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) 5ml(pH 7.6, 500ml)를 넣고 부드럽게 혼합합니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
   4. 2,300 x g에서 4°C에서 20분간 원심분리기.
   5. 상등액을 버리고 펠렛을 0.5ml의 TNE(10mM 트리스(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), 50mM NaCl, 1mM EDTA)에 용해시킵니다.
   6. 2,300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 잔여물을 제거합니다.
   7. 재조합 HBV를 함유한 TNE 0.5ml를 TNE의 20% 자당 0.8ml에 로드합니다.
   8. 15°C에서 3시간 동안 100,000×g의 원심분리기.
   9. 가능한 한 많은 상등액을 버리고 펠릿을 보관하십시오. 시작 배양 배지 40ml당 1ml의 무혈청 DMEM에 재현탁합니다.
   10. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
   11. 0.45μm 필터를 통해 필터링합니다. 0.5ml 분취액을 준비하고 -80°C에서 보관하십시오.
       메모: 원래 바이러스 샘플의 리포터 단백질 오염이 관찰되면 2시간 동안 100,000 x g에서 TNE의 5-30% 자당을 밀도 구배 초원심분리하거나 50시간 동안 150,000 x g에서 1.1-1.6g/ml의 CsCl 밀도 평형 원심분리로 바이러스를 정제합니다.

2. 재조합 HBV 감염

1. HBV 감염에 취약한 NTCP(타우로콜산나트륨 공동수송 폴리펩티드)(HepG2/NTCP)를 DMEM에서 안정적으로 발현하는 HepG2 세포를 배양하고, 37°C에서 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 250 μg/ml G-418(게네티신) 및 100 U/ml 비필수 아미노산을 가습된 5% CO₂ 인큐베이터에서
배양합니다.
2. 감염 하루 전, 약 5 x 10⁴ HepG2/NTCP 세포를 0.1ml의 배양 배지에 96웰 콜라겐 코팅된 플레이트에 플레이트합니다.
3. 바이알에 약간의 얼음이 남을 때까지 37°C 수조에서 재조합 HBV를 해동합니다.
4. 96웰 플레이트의 웰당 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 10μl, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 2μl, 재조합 HBV 10μl 및 신선 배양 배지 78μl에 40% PEG8000 10μl를 결합하여 감염을 위해 배지를 준비합니다.
5. 100μl의 재조합 HBV 용액을 96웰 플레이트의 한 웰에 추가합니다.
6. 감염 후 하루 만에 웰당 300μl PBS로 감염된 세포를 3회 세척하여 바이러스 분획에서 오염된 리포터 단백질을 제거합니다.
7. 감염된 세포를 200μl의 2% DMSO를 함유하는 배양 배지에서 일주일 이하로 배양합니다.

3. 분석

1. 감염 일주일 후 PBS로 감염된 세포를 3회 세척합니다.
2. 감염된 세포에 50μl의 용해 완충액을 추가합니다.
3. 배양 플레이트를 5분 동안 흔든 다음 2,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 리포터 기판 50μl를 광도계 플레이트에 추가합니다.
5. 20μl의 세포 용해물을 리포터 기판이 포함된 광도계 플레이트에 추가합니다. 간단히 볼텍싱으로 혼합합니다.
6. 광도계에 플레이트를 놓고 판독을 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nano-Glo Luciferase 분석 리젠트	프로메가	N1110
페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액	나칼라이 테스크	제09367-34
MEM 비필수 아미노산 용액	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM을 참조하십시오.	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I 리듀스 세럼 미디엄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31985070
100mm/콜라겐 코팅 접시	이와키	4020-010
Lipofectamine 3000 트랜스펙션 시약	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	L3000001
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 6000	시그마-알드리치	81255
폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000	시그마-알드리치	89510
염화나트륨	나칼라이 테스크	31319-45
0.5 mol/l-EDTA 용액	나칼라이 테스크	제06894-14
트리스 - HCl	나칼라이 테스크	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, 폴리에틸렌 에테르설폰, 필터	머크 밀리포어	SLHP033RS
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D2650
콜라겐 코팅 96웰 플레이트	코 닝	NO3585
패시브 리시스 5xBuffer	프로메가	1941
GloMax 96 마이크로플레이트 광도계	프로메가	E6501
자당	나칼라이 테스크	30403-55
광도계 플레이트	그라이너 바이오 원	655075
헵G2-NTCP1-myc-클론22	-	-	Nishitsuji, H., et al. 암. Sci. (2015)
pUC1.2HBV 델타 엡실론	-	-	Nishitsuji, H., et al. 암. Sci. (2015)
pUC1.2HBV/NL	-	-	Nishitsuji, H., et al. 암. Sci. (2015)
튜브 50ml	비올라모	1-3500-02
Anti-Myc 항체	시그마-알드리치	C3956
HBIG (하이빅)	일본 혈액 제제 기구	-
IFN-β	모치다 제약	1.49872E+13
덤플링을	시그마-알드리치	H3393

【무슨】 호 ) ) ) 년 ) 년 년 호 년 년 년