실험 화합물을 투여하기 위한 성인 제브라피쉬의 구강 삽관

초록

출처: Ji, J., Thwaite, R. et al. 성인 제브라피쉬의 구강 삽관: 생체 활성 화합물의 장 흡수를 평가하기 위한 모델. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 성체 제브라피시를 구강 삽관하여 실험 화합물을 식도에 투여하고 장 흡수를 모니터링하는 기술을 보여줍니다. 이 방법은 장 내 경구 예방제 또는 기타 화합물의 역학을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토

되었습니다.

1. 필요한 솔루션

1. 제브라피쉬가 서식하는 수족관의 물로 150mg/L(마취용) 또는 300mg/L(안락사용) 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(MS-222) 용액을 준비합니다. 작은 탱크에 1L의 마취액을 채우고 통기 상태를 유지하십시오.
2. 물고기 회수를 위해 MS-1 없이 다른 작은 탱크에 2222L의 수족관 물을 채우고 통기 상태를 유지하십시오.
3. 10x 멸균 원액에서 50mL의 1x PBS를 만듭니다.
4. 세포 분석 / 장 세포 분리를 위해 1 % v / v 페니실린 및 스트렙토 마이신이 포함 된 Dulbecco의 변형 독수리 배지 (DMEM)의 원료 용액 또는 분말에서 물고기 당 1mL에 대한 충분한 신선한 0.15 % 콜라겐 분해 효소 유형 IV 용액을 준비합니다 (재료 참조). 2mL 원심분리 튜브에 1mL의 부분 표본(물고기당 1개)을 만듭니다. 해부 단계 30분 전까지 4°C를 유지하십시오.
5. 컨포칼 현미경/샘플 고정을 위해 PBS에 50mL의 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비하거나 -20°C 냉동고의 흄 후드에서 원액을 해동합니다.
   주의: PFA는 독성이 있습니다. 작업하기 전에 물질 안전 데이터 시트를 읽으십시오. 장갑과 보안경을 착용해야 하며 항상 배기 후드 내부에 용액을 두십시오.

2. 구강 삽관을 위한 장비 준비

1. 바늘 끝을 덮기 위해 1G Luer Lock 바늘에 약 31cm의 미세한 실리콘 튜브를 놓습니다.
2. 10μL 멸균 필터 피펫 팁(약 2cm)을 자르고 더 미세한 끝을 취하여 실리콘 튜브 위에 덮개로 놓습니다. 동물이 다치지 않도록 피펫이 바늘 끝을 넘어 확장되었는지 확인하십시오.
3. 바늘을 100μL 루어 잠금 주사기에 부착합니다.
   메모: 항상 에탄올로 헹구고 인산염 완충 식염수(PBS, 재료 참조)로 치료 사이에 철저히 헹굽니다.

3. 형광 나노 입자 현탁액 제조

1. 단백질 나노 입자를 Atto-488 NHS 에스테르(재료 표 참조) 또는 제조업체의 지침에 따라 적절한 형광 염료로 라벨을 부착합니다.
2. 0.1M 중탄산나트륨 완충액에 나노 입자를 2mg/mL 농도로 재현탁합니다.
3. Atto 488 NHS 에스테르를 2mg/mL의 아민이 없는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킵니다. 10 μL의 부분 표본을 유지하여 라벨링 효율성을 확인하십시오.
4. 어두운 곳에서 교반하여 나노 입자와 Atto 488 NHS 에스테르를 몰 비율 1:2(단백질: 염료)로 혼합합니다.
5. 라벨링된 나노입자를 실온에서 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 스핀다운하고 상층액을 제거한 후 라벨링 효율을 확인하기 위해 보관합니다.
6. 라벨링된 나노입자를 0.1M 중탄산나트륨 완충액 1mL에 볼텍싱하고 위아래로 피펫팅하여 재현탁하여 세척합니다. 그런 다음 상층액을 8,000 x g에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 폐기합니다. 3.6단계를 5회 반복합니다.
7. 펠릿을 15mL 원심분리 튜브에 0.1M 중탄산나트륨 완충액 5mL에 재현탁하고 1.5mL 원심분리 튜브(부분 표본 30개)에 형광 나노입자의 부분 표본을 만듭니다. 실온에서 8,000 x g에서 10분 동안 스핀다운하고 상층액을 버리고 -80°C에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다.

4. 제브라피쉬 마취 및 구강 삽관

1. 실험 최소 48시간 전에 생선(>0.5g)을 단식하여 장을 비웁니다.
2. 순응을 위해 실험 하룻밤 전에 물고기(12마리)를 실험용 수조(6L)로 옮깁니다12.
3. 나노 입자 용액을 잘 와류(예: 2,500rpm 및 30초)하고 보호된 바늘에 부착된 주사기로 원하는 부피의 나노 입자 현탁액(예: 20–50μL)을 끌어올립니다.
4. 물고기가 탱크 바닥으로 가라앉고 꼬리 지느러미 꼬집음에 반응하지 않을 때까지 폭기된 150mg/L MS-222 용액(섹션 1 참조)에 물고기를 넣습니다. 이 과정은 5분 미만이 소요됩니다.
5. 그물로 마취 된 물고기를 젖은 플라스틱 쟁반으로 빠르게 옮기고 동물이 바늘을 향하도록 수평으로 향하게 한 다음 즉시 구강 삽관을 시작하십시오.
6. 한 손으로 물고기를 조심스럽게 지지하고 보호된 바늘을 사용하여 다른 손으로 입을 엽니다. 입 입구에서 약 1cm 떨어진 곳까지 식도로 바늘을 부드럽게 삽입합니다.
   메모: 작업자는 피펫 팁의 끝이 아가미를 통과할 때 약간의 저항을 느낄 수 있습니다. 바늘 입구의 각도가 너무 커서 아가미가 뚫릴 수 있으므로 주의하십시오.
7. 나노 입자 현탁액을 물고기에 천천히 주입합니다. 서스펜션이 아가미나 입을 통해 바깥쪽으로 흐르지 않도록 하십시오.
8. 바늘을 부드럽게 제거하고 물고기를 회수 탱크에 넣습니다(섹션 1 참조). 회복에는 보통 1분이 걸립니다.
9. 물고기에 이상이 있는지 주의 깊게 확인하십시오(예: 아가미에서 출혈이 있는 것은 천공의 징후입니다).
10. 물고기가 회복되면 실험용 수조로 되돌려 놓습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실리콘 튜브	다우코닝	전화: 508-001	0.30 mm 내경 및 0.64 mm 외경
루어 잠금 바늘	해밀턴	7750-22	31G, Kel-F 허브
루어 락 주사기	해밀턴	81020년 01	100 μL, Kel-F 허브
여과된 피펫 팁	네르베 플러스	07-613-8300	10 μL
MS-222	시그마 알드리치	E10521	가루
PBS 10배	시그마 알드리치	P5493
여과지	필터 랩	RM14034252
Atto-488 NHS 에스테르	시그마-알드리치	41698
DMEM을 참조하십시오.	지브코	31966	둘베코의 변형된 독수리 배지
Maxwell RSC simplyRNA 조직 키트	프로메가	AS1340

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