면역 역량이 있는 설치류 모델에서 폐렴 연쇄상구균의 기관지 내 주입

초록

출처: Hoover, J. L., et al., S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa 또는 A. baumannii에 대한 항균 효능을 평가하기 위한 면역 역량 설치류의 강력한 폐렴 모델. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 삽관 및 폐엽에 박테리아 현탁액 설치를 통해 면역 능력이 있는 설치류 모델에서 폐 감염이 확립되는 것을 보여줍니다. 이 모델은 면역 능력이 있는 동물에서 항균 효능 연구를 가능하게 합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물의 마취, 삽관 및 예방 접종

참고: 체중이 100 - 120g인 특정 병원균이 없는(SPF) 면역 능력이 있는 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 권장합니다. 모든 동물에게 음식과 물을 자유자재로 제공하고 표준 12시간 명암 주기로 나무 조각이나 기타 흡수성 침구에 사회적으로 수용합니다.

1. 실험을 수행하기 전에 동물 종에 적합한 크기의 금속 캐뉼라와 폴리에틸렌 튜브를 구하여 멸균하십시오. 멸균 1mL 일회용 주사기와 멸균 일회용 25게이지 바늘을 구합니다.
   주의: 이러한 주사기와 바늘은 항상 날카로운 물건 용기에 넣어 폐기하십시오.
   1. 쥐의 경우 길이가 약 12cm이고 ID가 0.9 - 1.0mm이고 OD가 1.0 - 1.2mm이며 한쪽 끝이 약 45° 각도로 구부러진 금속 캐뉼라를 구입하거나 제조합니다. ID가 0.4mm이고 OD가 0.8mm인 11-12인치 길이의 폴리에틸렌 튜브를 자릅니다(그림 1A 참조).
   2. 금속 캐뉼러를 유리, 나사 캡 튜브에 넣고 표준 방법으로 오토클레이브하여 살균합니다. 절단된 길이의 폴리에틸렌 튜브를 알코올이 들어 있는 덮개가 있는 비커에 담그고 보관하십시오.
2. 작업대와 삽관 장치를 준비합니다.
   1. 수조에 가까운 작업 표면에 깨끗한 일회용 매트를 놓습니다. 유리 저장 튜브에 있는 금속 캐뉼라를 이 표면으로 옮깁니다. 보관 튜브에서 캡을 제거하고 캐뉼라의 "손잡이" 끝을 튜브의 열린 끝으로 밉니다.
   2. 멸균 집게를 사용하여 비커에서 한 길이의 폴리에틸렌 튜브를 제거하고 멸균 금속 캐뉼라 내부를 통해 삽입하여 자유롭게 움직이는지 확인합니다. 바늘을 튜브에 몇 mm 밀어 넣어 멸균 일회용 25게이지 바늘(쥐용)을 폴리에틸렌 튜브의 자유 끝에 끼웁니다. (쥐는 그림 1A 참조).
   3. 금속 캐뉼러와 폴리에틸렌 튜브 모두에 가이드 마크를 부착하여 단일 안락사 동물에 대해 아래에 설명된 삽관 절차에 따라 동물의 삽입 깊이를 표시합니다. 관찰을 위해 흉강을 연 다음 금속 캐뉼라를 적절하게 배치하고 폴리에틸렌 튜브를 적절하게 전진시킵니다. 지울 수 없는 펜을 사용하여 동물의 입과 만나는 곳에 금속 캐뉼라를 표시하고 금속 캐뉼라 상단과 만나는 곳에 폴리에틸렌 튜브를 표시하여 나머지 동물에 적절하게 배치할 수 있도록 합니다.
3. 흄 후드 내에서(또는 적절한 청소 시스템 사용) 개그 반사가 억제될 때까지(약 1분) 1.5L/min 산소에 ≤5% 이소플루란이 공급되는 밀폐된 챔버에서 한 번에 최대 6마리의 동물을 마취합니다.
   메모: 실험을 수행하기 전에 부주의한 치명적 노출을 방지하기 위해 사용되는 특정 조건(예: 챔버의 크기/유형 및 동물의 크기/종/균주)에서 이소플루란의 안전한 용량과 노출 시간을 설정합니다.
4. 멸균 일회용 1mL 주사기(쥐용)에 멸균 팁을 식염수에 넣고 플런저에서 다시 당겨 멸균 식염수를 채웁니다. 폴리에틸렌 튜브에 장착된 바늘에 주사기를 부착하고 주사기가 비워질 때까지 튜브를 통해 전체 식염수를 씻어냅니다.
5. 수조에 담긴 용기에서 나온 한천 기반 접종물을 주사기에 채우고 튜브가 프라이밍될 때까지(예: 한천으로 완전히 채워질 때까지) 튜브를 통해 한천을 세척합니다.
   1. 쥐의 경우 일회용 주사기에서 25게이지 바늘(폴리에틸렌 튜브에 장착됨)을 제거합니다. 사용한 주사기는 날카로운 물건 용기에 넣어 버리십시오. 멸균 팁을 접종물에 넣고 플런저를 뒤로 당겨 용기의 한천 기반 접종물을 새 멸균 일회용 1mL 주사기에 채웁니다. 바늘(폴리에틸렌 튜브에 장착됨)을 다시 부착하고 튜브가 한천으로 완전히 채워질 때까지 플런저를 눌러 튜브를 통해 한천을 세척합니다.
6. 마취실에서 동물 한 마리를 꺼냅니다. 그림 1C와 같이 머리는 오른쪽, 꼬리는 왼쪽으로 향하게 하여 동물을 일회용 매트 위에 누운 자세로 놓습니다.
7. 삽관 장치(즉, 폴리에틸렌 튜브가 장착된 금속 캐뉼라)를 사용하여 동물을 삽관하고 캐뉼라를 왼쪽 폐의 대엽에 삽입합니다(그림 1D 참조).
   1. 금속 캐뉼라의 다른 쪽 끝을 동물의 입에 삽입합니다. 캐뉼라를 돌려 자유 끝이 위쪽으로 기울어지도록 하고 약간 비틀는 동작으로 후두 구조를 조심스럽게 우회하여 기관으로 부드럽게 전진시킵니다. 그림 1C와 같이 왼쪽 집게손가락으로 기관 고리를 촉진하면서 캐뉼라를 약간 앞뒤로 여러 번 부드럽게 밀어 식도가 아닌 기관으로의 삽입을 확인합니다.
   2. 캐뉼라가 기관이 왼쪽과 오른쪽 기관지로 갈라지는 분기점에 도달하면 캐뉼라가 왼쪽 기관지에 삽입되도록 동물의 왼쪽을 향해 약간 비틀는 동작을 합니다. 금속 캐뉼라의 끝이 왼쪽 폐의 절반에서 4분의 3 지점이 될 때까지 전진시키고, 이전에 배치된 가이드 마크를 사용하여 적절한 깊이에 도달했는지 확인합니다.
   3. 금속 캐뉼라를 제자리에 놓고 폴리에틸렌 튜브를 몇 mm 전진시킵니다. 튜브에 미리 배치된 가이드 마크를 사용하여 금속 캐뉼라의 끝에서 빠져나와 폐에 구멍을 뚫지 않을 만큼만 전진했는지 확인합니다.
8. 두 캐뉼라가 모두 제자리에 있는 상태에서 부착된 주사기를 사용하여 한천 현탁액의 100μL(쥐의 경우)를 왼쪽 폐의 대엽 깊숙이 주입합니다(그림 1D 참조). 폴리에틸렌 튜브를 몇 mm 정도 빼낸 다음 손상되지 않은 삽관 장치를 부드럽게 제거합니다. 유리 보관 튜브에 다시 넣고 동물을 새 우리로 옮겨 회복하세요.

결과

그림 1: 비수술적 기관내 삽관. 쥐(A)와 쥐(B)를 삽관하기 위한 도구가 표시되어 있습니다. 일단 마취가 끝나면 동물은 C와 같이 위치를 잡아야 하며, 기술을 수행하는 개인이 오른손잡이인 경우 머리는 오른쪽에, 꼬리는 왼쪽에 위치해야 합니다. 왼쪽 집게 손가락을 목구멍에 부드럽게 대면 기관 고리를 촉진하여 올바른 캐뉼라 배치를 확인할 수 있습니다. 접종물은 쥐 폐(D)의 복부 보기에서 볼 수 있듯이 왼쪽 폐 깊숙이 삽입해야 합니다. 샘플의 연속 희석 및 도금 후 한천에서 자라는 콜로니는 E에 표시된 것과 유사하게 나타나야 합니다. 그림 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
가이드 도구	Intek 서비스 회사	GT01
1mL TB 주사기 슬립 팁	벡턴 디킨슨 앤 컴퍼니	309659
PrecisionGlide 바늘 25g×5/8	벡턴 디킨슨 앤 컴퍼니	305122
의료용 폴리에틸렌 튜브	클레이 아담스 브랜드 - Becton Dickinson and Company	427401	마우스용 플라스틱 캐뉼러
동물 먹이 바늘 - 스트레이트 20 x 3" 2-1/4	포퍼 앤 선즈, Inc	7903	마우스용 금속 캐뉼러를 만드는 데 사용됩니다.
75 TN 5.0 μL 주사기 26s/2"/2	해밀턴	87930	HPLC 유리 주입 주사기
Difco 영양 한천	벡턴 디킨슨 앤 컴퍼니	213000
파이렉스 튜브, 고무 라인이 있는 배양 25x150 스크류캡	코 닝	9825-25	금속 캐뉼라를 오토클레이브/보관하려면
PrecisionGlide 바늘 25g×5/8	벡턴 디킨슨 앤 컴퍼니	305122
70% 이소프로필 알코올	Vi-Jon (스완)	국토통신번호 0869-0810-43
이소플루란, USP	피라말 헬스케어	재질 보기 NDC 66794-013-10
50mL 폴리프로필렌 원추형 튜브 30 x 115mm	Falcon, 코닝 브랜드	352070
75 TN 5.0 μL 주사기 26s/2"/2	해밀턴	87930	HPLC 유리 주입 주사기