쥐에서 만성 실험용 자가면역 안구 건조증을 유발하는 기술

초록

출처: Hou, A., et al. 안구 조직에서 효과 기억 T 세포가 증가하는 만성 자가면역 안구 건조 쥐 모델. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 쥐에서 만성 실험용 자가면역 안구건조증을 유발하는 기술을 보여줍니다. 자가항원과 외부 항원을 함유한 항원 보조 에멀젼을 미리 정의된 간격으로 쥐에게 주입하면 면역된 쥐에서 동일한 항원을 안구 표면 조직에 주입하여 만성 안구 염증을 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 눈물샘 추출물의 준비

참고: 쥐는 케타민(75mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 복강 내 주사로 마취되었습니다. 적절한 마취는 발가락 꼬집기와 꼬리 꼬집기로 확인되었습니다. 각 시술 후 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 안과 젤을 도포했습니다. 마취된 쥐들은 완전히 회복될 때까지 동물들을 따뜻하게 유지하기 위해 원적외선 조명 아래에 놓였습니다. 절차와 회복 기간 동안 연구원들은 동물들을 면밀히 모니터링했습니다. 모든 재료와 수술 도구는 사용하기 전에 멸균 상태였습니다. 실험이 끝날 무렵, 쥐는 펜토바르비탈(80mg/kg)의 복강내 주사로 안락사되었습니다. 완전한 안락사는 심장 맥박이 뛰지 않고 안구를 만져도 눈을 깜박일 반사가 없는 것으로 확인되었습니다. 쥐는 표준 조건에서 사육되었습니다 : 실온, 21-23 ° C; 상대 습도, 30-70%; 명암 주기, 12시간(오전 7시부터 오후 7시까지)을 번갈아 가며 반복합니다.

1. 안락사된 암컷 Sprague-Dawley 쥐(8주에서 16주 사이)를 한쪽 귀는 테이블에 대고 다른 쪽 귀는 위를 향하도록 평평하게 놓습니다. 용수철 가위로 노출된 귀 아래 10mm 절개를 만듭니다. 눈물샘을 주변 결합 조직과 배액관에서 절개하여 제거합니다.
   1. 필요할 때까지 땀샘을 -80°C에서 보관하십시오. 얼음 위에서 땀샘을 녹입니다. 얼음 위에서 가위로 최대한 잘게 다집니다. 눈물샘당 1x 프로테아제 억제제와 함께 150μL의 PBS를 추가합니다.
2. 얼음 위에서 20kHz에서 5분 동안 샘플을 초음파 처리하고 초음파 처리기를 10초 켜기로 설정하고 30% 진폭에서 10초 끕니다. 초음파 처리 된 샘플을 13,000 x g 및 4 ° C에서 20 분 동안 원심 분리합니다.
3. 상등액을 피펫팅하고 새 튜브로 옮깁니다. 상층액을 1.5mL 튜브에 분주하고 -80°C에서 보관합니다. 제조업체의 지침에 따라 bicinchoninic acid assay로 단백질 농도를 측정합니다.

2. 에멀젼 및 백일해 독소의 제조

1. 유제
   1. 1mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra를 함유한 완전한 Freund's adjuvant 10mL에 열에 의해 사멸된 Mycobacterium tuberculosis H37Ra 40mg을 첨가하고 잘 섞습니다.
      메모: 최종적인 완전한 Freund's adjuvant에는 5mg/mL의 Mycobacterium tuberculosis H37Ra가 포함되어 있습니다.
   2. 오브알부민의 무게를 측정하고 PBS에 용해시킨 후 2mg/mL의 오브알부민과 10mg/mL의 눈물샘 추출물을 함유한 항원 혼합물을 제조합니다. 각 동물에 대해 200μL의 주입량을 목표로 동물 수를 기반으로 마스터 혼합물을 준비합니다.
   3. 불완전 프로인드 보조제 또는 완전 프로인드 보조제를 50mL 튜브로 옮겨 항원 혼합물에 대한 보조제의 부피가 1:1 비율이 되도록 합니다. 항원 혼합물을 보조제에 한 방울씩 첨가하면서 가장 빠른 속도로 볼텍싱하여 유출이 발생하지 않도록 합니다. 모든 항원이 추가된 후 5분 동안 계속 소용돌이합니다.
   4. 에멀젼을 5mL 주사기로 옮기고 주사기 커넥터를 통해 다른 5mL 주사기와 연결합니다. 한 주사기에서 다른 주사기로 에멀젼을 밀어 혼합합니다.
      메모: 에멀젼은 물에 넣었을 때 단일 물방울이 구로 남아 있으면 준비가 된 것입니다. 갓 준비된 에멀젼 또는 4°C에서 밤새 보관된 에멀젼만 사용해야 합니다.
2. 백일해 독소
   1. 500μL의 물에 50μg의 백일해 독소를 재구성하여 최종 농도를 100ng/μL로 만듭니다. 독소가 완전히 용해되도록 용기를 30초 동안 가열합니다.
      메모: 재료 손실이 발생할 수 있으므로 여과로 살균하지 마십시오. 얼리지 마십시오. 이 용액은 4°C에서 최소 6개월 동안 활성을 유지합니다.
   2. PBS를 사용하여 100ng/μL의 백일해 독소를 3ng/μL로 희석합니다. 27G 바늘을 사용하여 100μL의 희석된 백일해 독소를 1mL Luer-lock 주사기로 옮깁니다.

3. 루이스 쥐의 면역

1. 0일차에 에멀젼을 몇 번 혼합합니다. 완전한 Freund's adjuvant에 눈물샘 추출물 1mg과 오브알부민 200μg을 함유한 에멀젼 200μL를 27G 바늘이 있는 1mL Luer-lock 주사기에 분배합니다. 마취없이 쥐 꼬리 기저부에 에멀젼을 피하로 주입하십시오 .
   메모: 꼬리는 주사 전에 미리 데울 필요가 없습니다. 각 쥐는 1mg의 눈물샘 추출물과 200μg의 오브알부민으로 500μg의 Mycobacterium tuberculosis H37Ra와 함께 완전한 Freund 보조제로 면역됩니다.
2. 14일째에 0일째와 동일한 방식으로 눈물샘 추출물 1mg과 오브알부민 200μg을 함유한 에멀젼 200μL를 불완전 프로인트 보조제에 주입합니다. 같은 날 랫트 한 마리당 100μL의 PBS에 300ng의 백일해 독소를 복강내로 주입합니다.

4. 항원 혼합물을 Forniceal subconjunctiva 및 Lacrimal gland에 주입하여 항원 특이적 면역 세포를 모집하고 국소 염증을 유발합니다.

1. 실험에 참여한 쥐의 수를 기준으로 오브알부민과 눈물샘 추출물의 양을 계산합니다. 필요한 양의 오브알부민의 무게를 측정하고 1단계에서 준비한 해동된 눈물샘 추출물과 결합하여 1mg/mL 오브알부민과 1mg/mL의 눈물샘 추출물을 포함하는 항원 용액을 만듭니다.
2. 복강내 주사로 케타민(75mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)으로 쥐를 마취합니다. 쥐의 발가락을 꼬집어 적절한 마취가 이루어졌는지 확인합니다(즉, 꼬집음 후 반응하는 움직임이 관찰되지 않음). 5μL의 항원을 눈의 결막하결막에 주입합니다. 20μL의 항원을 눈물샘에 주입합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
프로테아제 억제제 칵테일	시그마-알드리치	P2714-1BTL(영문)
Pierce BCA 단백질 분석 키트	써멀 사이언티픽	23227
결핵균 H37Ra	Becton, Dickinson 및 회사	231141
프로인트의 보조제 완료	Becton, Dickinson 및 회사	231131
오브알부민	시그마-알드리치	A5503-10G
불완전한 프로인트 보조제	시그마-알드리치	F5506-6X10ML
백일해 독소	시그마-알드리치	P7208-50UG
플루오레세인 나트륨 용액	Bausch & Lomb 영국 제한	해당 없음
설비
초음파 처리기	음향파	비브라 셀
마이크로 IV 현미경	피닉스 연구소	해당 없음

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