IgG-Opsonized 적혈구의 대식세포 식세포작용(Macrophage Phagocytosis)의 실시간 이미징

초록

출처: Horsthemke, M., et al. 마우스 대식세포에 의한 식세포작용의 타임랩스 3D 이미징. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 독립적인 대식세포 매개 적혈구(RBC) 식세포작용 이벤트를 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. 마우스 면역글로불린 G(IgG)-옵소니화된 인간 적혈구를 마우스 대식세포와 함께 배양하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다. 적혈구는 식세포컵(phagocytic cup) 형성을 통해 대식세포에 포위되어 리소좀 분해를 목표로 합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 채널 슬라이드에서 복막 세포의 시딩

1. 복막 마우스 대식세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 응집을 줄인 후, 피브로넥틴으로 코팅된 채널 슬라이드(100μL 채널의 크기(길이 x 너비 x 높이: 50 mm x 5 mm, 0.4 mm)의 미리 채워진 채널(부피, 100 μL)에 100 μL 현탁액을 피펫팅합니다.
   1. 채널 슬라이드의 두 reservoir 중 하나에 1mL 혈청이 보충된 RPMI 1640(Hepes) 배지를 추가하고 슬라이드를 기울인 다음 다운스트림 reservoir에서 배지를 흡인하여 챔버를 미리 채웁니다(그림 1).
      1. 두 개의 저장소 중 하나에 1-2mL 매체를 추가하고 저장소 캡을 단단히 적용한 다음 캡의 리드미컬한 엄지 손가락 압력을 통해 공기를 펌핑하고 필요한 경우 슬라이드를 기울여 채널에서 원치 않는 기포 또는 긴 공기 스트립을 제거합니다. 공기를 배출한 후 캡을 제거하기 전에 캡이 없는 저장소(및 포함 매체)가 있는 슬라이드를 아래쪽으로 기울여 공기가 채널로 다시 흡입되는 것을 방지하십시오.
2. CO₂가 없는 상태에서 37°C에서 2시간 동안 축축한 챔버에서 세포가 파종된 채널 슬라이드를 배양합니다(HCO₃-/CO₂ 버퍼 시스템이 Hepes로 대체되기 때문에 CO₂는 필요하지 않음). 채널 슬라이드는 8개의 슬라이드를 수용할 수 있는 랙에 편리하게 배치할 수 있습니다. 일반적으로 한 개의 마우스에서 6-8개의 슬라이드를 준비하지만 최대 10개 이상까지 가능합니다.
3. 랙을 제거하고 각 슬라이드의 RPMI 1640(Hepes) 배지를 10% 소 태아 혈청과 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 중탄산염이 함유된 RPMI 1640 배지로 교체합니다.
   1. 슬라이드를 기울이고 먼저 하단 저장소에서 매체를 흡인한 다음 상단 저장소에서 흡입합니다. 다음으로, 1mL의 새 배지를 저장소 중 하나에 추가하고, 슬라이드를 기울이고, 매체가 채널을 통해 흐른 후 다운스트림 저장소에서 매체를 흡입합니다.
   2. 이 세척(배지 교환) 단계 후 저장소 중 하나에 1mL 배지를 추가하여 채널 슬라이드를 채웁니다.
      메모: 채널 슬라이드를 사용한 세척 단계는 용액 교환 및 비부착 세포 제거 측면에서 매우 간단하고 효과적입니다. RPMI 1640(중탄산염) 배지는 일반적으로 열 및 pH 평형을 보장하기 위해 하룻밤 동안 5% CO₂로 사전 배양됩니다.
4. 37°C에서 5% CO₂가 함유된 가습 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 다음 날에 실험을 수행합니다.

2. 인간 적혈구의 분리

1. 2일차(실험 2일차, 분리된 복막 대식세포를 하룻밤 동안 배양한 후)에 건강한 기증자로부터 1-2mL의 말초 정맥혈을 헤파린화된 튜브에 수집합니다. 1mL를 둥근 바닥 2.0mL(폴리프로필렌) 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 300 x g에서 18°C(경험적 설정)에서 5분 동안 원심분리한 다음 상등액(플라즈마 및 버피 코트)을 제거합니다.
2. 침전된 적혈구 100μL를 부드럽게 흡인하고 이 부피를 둥근 바닥 2.0mL 마이크로 원심분리 튜브에서 변형된 RPMI 1640(Hepes) 배지(아래 설명 참조)와 1:1로 혼합합니다. 튜브에 "1:1".
   레이블을 지정합니다. 메모: 세포 분리 후 2일차(분석용)에 사용되는 RPMI 1640(Hepes) 배지에는 10% 열 불활성화 소 태아 혈청, 페니실린(100 units/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 1mM N-(2-메르캅토프로피오닐)글리신(광독성 감소용)이 포함되어 있습니다. 이하, 이 배지는 "수정된" RPMI 1640(Hepes) 배지로 지칭된다.
3. 1:1 희석된 적혈구 현탁액 4μL를 2mL 변형 RPMI 1640(Hepes) 배지에 피펫으로 주입하고 2.0mL 마이크로 원심분리 튜브에 미리 피펫팅합니다(이 단계 반복, 즉 튜브 2개 준비). 각 튜브에 "4:2000"이라는 레이블을 지정합니다. "1:1" 및 "4:2000" 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

3. 대식세포 원형질막의 라벨링

1. CO₂ 인큐베이터에서 파종된 채널 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드의 RPMI 1640(중탄산염) 배지를 수정된 RPMI 1640(Hepes) 배지로 교체합니다. 다음으로, CO₂.
   가 없는 37°C의 습한 챔버에 셀을 배치합니다. 메모: 하룻밤 동안 배양하고 세척한 후 대부분의 림프구가 채널에서 제거됩니다. 나머지 부착 세포의 대부분은 대식세포이며, 이는 형태학적으로 또는 anti-F4/80 항체를 사용한 면역형광 염색으로 식별할 수 있습니다. 쥐에 상주하는 복막 대식세포의 약 95%가 F4/80 양성입니다.
2. 형광 녹색 표지 항 마우스 F4/80 항체(4°C에서 보관) 1:40을 변형된 RPMI 1640(Hepes) 배지에 희석합니다. 슬라이드를 가져와서 기울여 100μL의 항체 혼합물을 슬라이드의 100μL 채널 입구에 피펫(한 방울 한 방울)합니다(그림 1 참조). 다운스트림 저장소로 유입되는 흡입 매체. 37 ° C에서 20 분 동안 세포를 배양합니다 (가습 환경, CO₂ 없음). 잠복기 동안 인간 적혈구에 라벨을 붙입니다(섹션 5 참조).
   메모: 위에서 언급했듯이 HCO₃-/CO₂ 완충 시스템이 Hepes로 대체되었기 때문에 CO₂ 는 필요하지 않습니다.
3. 20분의 배양 시간(인간 적혈구가 염색되고 옵소니화되는 동안) 저장소 중 하나에 1mL 변형 RPMI 1640(Hepes) 배지를 첨가하고 슬라이드를 기울여 채널을 통해 흐른 후 배지를 흡인하여 슬라이드를 세척합니다. 단기 보관을 위해 1mL 배지를 추가하거나 실험을 진행합니다(예: 입자(옵소니화된 적혈구) 피펫팅 및 타임 랩스 회전 디스크 컨포칼 현미경에 의한 식세포작용 이미징).

4. 인간 적혈구의 원형질막 라벨링

1. 녹색 형광 표지된 항-F4/80 항체가 있는 대식세포 슬라이드를 배양한 직후 인간 적혈구 라벨링을 시작합니다(섹션 3.2 이후). 부드럽게 혼합한 후 "4:2000" 튜브(섹션 2.3 참조) 중 하나에서 400μL를 취하여 (둥근 바닥) 2.0mL 마이크로 원심분리 튜브에 분배합니다. 현탁액이 약 37°C까지 예열될 때까지 기다립니다(아래 단락 참조). 0.4 μL 주황색/적색 형광 원형질막 염색(-20 °C에서 보관된 분취량)을 추가하고, 37 °C에서 5분 동안 혼합 및 배양합니다.
   메모: 층류 후드 내부에 배치된 가열된 알루미늄 블록은 슬라이드를 준비하는 동안 열 손실을 최소화하는 데 유용합니다. 튜브는 가열 블록의 보어 웰에 배치할 수 있으며 별도의 또는 통합형 가열된 알루미늄 플레이트는 작업 공간으로 사용할 수 있습니다.
2. 5분의 배양 기간 후 1600μL 변형 RPMI 1640(Hepes) 배지를 첨가하여 첫 번째 세척 단계를 준비합니다(2.0mL 마이크로 원심분리 튜브 충전).
3. 300 x g에서 18°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다(경험적 설정). 조밀한 빨간색 펠릿은 튜브 바닥의 벽(즉, 중심에서 벗어남)에서 볼 수 있어야 합니다. 펠릿이 위쪽을 향하도록 튜브를 회전하고 1–1.5mL 피펫 팁을 사용하여 모든 상층액을 연속적으로(2단계로) 조심스럽게 제거합니다.
4. 상층액을 흡인시킨 후 2,000μL modified RPMI 1640(Hepes) 배지를 첨가하고 혼합(세포를 재현탁하기 위해)한 다음 위의 원심분리 및 상등액 흡인 단계를 반복합니다.
5. 펠릿(원형질막 염색 및 2x 세척된 적혈구)을 400μL의 변형된 RPMI 1640(Hepes) 배지로 재현탁합니다. 튜브에 PMS(plasma membrane stain의 약자)를 표시합니다.
   메모: 대안적으로, 산성 pH에서 더 강하게 형광성을 띠게 되는 pH에 민감한 로다민 유도체의 숙시니미딜 에스테르를 사용하여 인간 적혈구를 라벨링할 수 있습니다. 이 경우, 형광 강도는 입자가 내재화된 후 식체 성숙의 척도로 추가적으로 작용합니다.

5. 마우스 면역글로불린 G(IgG)를 사용한 인간 적혈구의 옵소니제이션(라벨링)

1. 400μL 배지에 현탁된 원형질막이 염색된 인간 적혈구를 포함하는 PMS(섹션 4.2–4.5 참조)로 표시된 튜브에 1μL 마우스(IgG2b) 단클론(클론 HIR2) 항인간 CD235a(1mg/mL) 항체(-20°C에서 보관)를 추가합니다. CD235a(글리코포린 A라고도 함)는 적혈구 계통 특이적 막 시알로글리코단백질입니다.
2. 37°C에서 8분 동안 배양합니다.IgG가 있는 인간 적혈구의 옵소니화는 응집(세포 응집)을 유발합니다. 응집(agglutination)은 옵소니제이션(opsonization)의 시각적 지표로 작용할 수 있지만, 단일 식세포 효과(single phagocytic effect)의 이미징에는 바람직하지 않습니다. 응집을 피하려면 예를 들어 200 μL로 설정된 가변 20–200 μL 부피 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 반복적으로(1분마다) 혼합합니다.
   1. 8분의 배양 기간이 끝날 무렵, 원하는 경우 녹색 형광 표지된 anti-F4/80 항체로 배양한 대식세포 슬라이드를 1mL 변형 RPMI 1640(Hepes) 배지로 세척합니다. 세척 단계 후에 채널 슬라이드의 두 저장소에 매체가 없는지 확인하십시오.

6. 원형질막이 염색되고 IgG로 코팅된 인간 적혈구의 식세포작용 이미징

1. 항-CD235a 항체로 8분 배양한 후(섹션 5.2), 원형질막 염색 및 IgG-옵소니화된 인간 적혈구를 포함하는 100μL 현탁액을 녹색 형광 항-F4/80 항체로 표지된 대식세포가 포함된 슬라이드의 채널로 피펫화합니다(3단계). 따라서 적색 형광, IgG-opsonized 인간 적혈구가 녹색 형광 식세포(대식세포)에 추가됩니다.
2. 인간 적혈구가 추가되는 즉시 회전 디스크 컨포칼 현미경(스테이지 인큐베이터를 37°C로 설정)에 채널 슬라이드를 장착하여 60X/1.49 오일 이멀젼 대물 렌즈 등을 통해 이미징합니다. 입자는 1분 이내에 침전되기 시작하므로 가능한 한 빨리 이미징을 시작하십시오.
   메모: 직경 100nm의 형광 비드를 사용하여 점 확산 함수 분석을 통해 x = 0.22μm, y = 0.23μm(488nm 레이저) 및 x = 0.27μm, y = 0.27μm(561nm 레이저)의 XY 해상도를 측정했습니다. 그러나 살아 있는 세포의 타임 랩스 3D 이미징 중 광표백 및 광독성을 줄이기 위해 2 x 2 비닝을 사용하여 공간 해상도를 절충합니다. 비닝은 감도(신호 대 잡음비 향상)와 허용 가능한 프레임 속도를 증가시키지만 공간 해상도를 희생합니다.
3. 완벽한 초점(또는 유사한) 시스템을 사용하여 녹음 중 초점 드리프트를 방지하십시오. 퍼펙트 포커스 시스템을 활성화한 후 오프셋 컨트롤을 사용하여 채널 슬라이드의 커버슬립(아래 참고 참조) 바로 위에 있는 대식세포 층상 돌출부에 초점을 맞춥니다. 이 초점 레벨은 Z = 0μm에 해당합니다. 0.8μm 단계에서 -1μm에서 +16μm까지 Z 스택을 얻을 수 있으며, 이는 22개의 Z 슬라이스에 해당합니다. 예를 들어, Z 스택은 총 16분 동안 15초마다 (각 채널에 대해) 1스택의 속도로 얻을 수 있습니다
   메모: 녹화 기간이 길어지면 주로 광표백으로 인한 이미지 품질 손실이 발생합니다. 대식세포는 488nm 레이저(녹색 채널)를 사용하여 이미지화하고 인간 적혈구는 561nm 레이저(빨간색 채널)를 사용하여 이미지화합니다. 이 접근법을 사용하면 서로 다른 시점에서 IgG-opsonized 인간 적혈구를 섭취하는 대식세포에 대한 다양한 견해를 얻을 수 있습니다(예: 그림 2 참조).
   메모: 시스템의 일반적인 설정(2 x 2 비닝 포함)은 녹색 채널(20.5% 레이저(50mW, 488nm) 출력, 101 감도(범위, 0-255) 및 200ms 노출 시간)입니다. 적색 채널 (10.5 % 레이저 (50mW, 561 nm) 출력, 101 감도 (범위, 0-255) 및 98ms 노출 시간) .
   메모: 채널 슬라이드의 바닥은 #1.5 유리 커버슬립과 동일한 두께와 유리와 동일한 광학 특성을 가진 폴리머이지만, 특히 이 재료는 가스 투과성의 장점이 있습니다.

결과

그림 1: 피브로넥틴 코팅된 채널 슬라이드의 처리. (A) 채널 슬라이드는 50mm x 5mm 0.4mm 크기의 채널로 연결된 두 개의 저장소로 구성됩니다. 채널 슬라이드는 처음에 1-2mL 매체를 두 개의 저장소 중 하나에 적용하고 슬라이드를 기울여 미리 채웁니다. (B) 배양 전에 뚜껑을 저장소에 놓을 수 있습니다. 캡은 세포로 채널을 파종하기 전에 원치 않는 기포를 펌핑하는 데 편리하게 사용할 수 있습니다. (C) 기포가 없는 100μL 채널은 배지를 채널의 입구에 직접 피펫팅하여 채울 수 있습니다. 이 단계는 예를 들어 대식세포를 슬라이드에 시드하거나 멤브레인 라벨 역할을 하는 gfluorophore(녹색 형광) 접합 항-F4/80 항체 및 마우스 대식세포 마커를 추가하는 데 사용됩니다. (D) 옵소니화된 인간 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24G 플라스틱 카테터	B Braun Mesungen AG, 독일	제4254503-01	복막 세척에 사용
Ca2+ 및 Mg2+가 없는 행크의 완충 염 용액	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	14170120	복막 세척에 사용
14mL 폴리프로필렌 원형 바닥 튜브	BD 팔콘	352059	복막 세포를 채취하는 데 사용
20mM 헤페스를 함유한 RPMI 1640 배지	시그마-알드리치	R7388	분석을 위한 기초 배지
열 불활성화 소 태아 혈청	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10082139	RPMI 1640 매체의 보조제로 사용
100x 페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	RPMI 1640 매체의 보조제로 사용
피브로넥틴 코팅 μ-Slide I 챔버	Ibidi, Martinsried, 독일	80102	분석에 사용되는 채널 슬라이드
μ-슬라이드(양극 산화 알루미늄) 랙	Ibidi, Martinsried, 독일	80003	채널 슬라이드를 위한 오토클레이브 가능한 적재 가능 랙
RPMI 1640 중탄산염을 함유한 배지	시그마-알드리치	R8758	하룻밤 문화를 위한 매체
N-(2-메르캅토프로피오닐)글리신	시그마-알드리치	M6635	활성산소종의 청소부
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 항체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	MF48020	Mouse macrophage marker 및 plasma membrane label
셀마스크 오렌지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C10045	적색 형광 플라즈마 멤브레인 염색
pHrodo의 Succinimidyl 에스테르	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	P36600	pHrodo의 아민 반응성 succinimidyl 에스테르
마우스(IgG2b) 단클론성(클론 HIR2) 항인간 CD235a	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	MA1-20893	IgG로 인간 적혈구를 옵소니화하는 데 사용됩니다
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse (secondary) IgG 항체	아브캠	AB150116	마우스 IgG를 사용한 인간 적혈구의 옵소니화를 확인하는 데 사용됩니다.
쥐 안티-마우스 C3b/iC3b/C3c 항체	하이컬트 바이오텍	HM1065	인간 적혈구의 C3b/iC3b 옵소니화를 확인하는 데 사용됩니다
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rat IgG 항체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A-11006	C3b/iC3b 옵소니화를 확인하기 위한 2차 항체로 사용
UltraVIEW Vox 3D 라이브 셀 이미징 시스템	Perkin Elmer, Rodgau, 독일		스피닝 디스크 컨포칼 현미경 시스템
Nikon Eclipse Ti 역 현미경	Nikon, 일본		도립 현미경
CSU-X1 회전 디스크 스캐너	Yokogawa Electric Corporation, 일본		Nipkow 회전 디스크 장치
14비트 Hamamatsu C9100-50 EM-CCD(Electron Multiplying-Charged Couple Device) 펠티에 냉각 카메라	Hamamatsu Photonics Inc., 일본		회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템의 EM-CCD 카메라
488nm 솔리드 스테이트 레이저, 50mW	Perkin Elmer, Rodgau, 독일		레이저(488 nm) 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템의 소스
561nm 솔리드 스테이트 레이저, 50mW	Perkin Elmer, Rodgau, 독일		레이저(561nm) 회전 디스크 컨포칼 현미경 시스템의 소스

호 ) ) ) 년 ) ) ) ) (영문) . . ) (영어)