암세포에 대한 자연살해세포매개 세포독성을 평가하기 위한 Calcein Acetoxymethyl 염색

초록

출처: Chava, S. et al., 간 종양 세포의 맥락에서 자연 살해 세포 매개 세포 독성 및 이동 측정. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오는 Calcein AM 염색을 사용하여 암세포에 대한 자연 살해 세포의 세포 독성을 측정하는 분석을 보여줍니다. 자연살해세포(natural killer cell)와의 배양 후 형광암세포의 수가 감소한 것은 암세포에 대한 자연살해세포 매개 세포독성을 나타냅니다.

프로토콜

1. Calcein AM 염색 기반 현미경 방법으로 NK 세포 매개 세포 독성 측정

1. SK-HEP-1 세포를 70-80% 포화도로 배양합니다. 먼저 5mL의 1x PBS로 세포를 세척한 후 1mL의 0.25% 트립신-EDTA로 배양하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
2. 1mL 멸균 원심분리 튜브에 160 x g의 원심분리기 SK-HEP-1 세포를 3분 동안 원심분리기 주입합니다.펠릿을 3mL의 무혈청 DMEM에 재현탁합니다.
3. SK-HEP-1 세포에 1.5μL의 calcein AM 용액(10mM)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 15mL 멸균 원심분리 튜브에서 160 x g에서 3분 동안 원심분리기 calcein AM 표지 SK-HEP-1 세포.
4. 5mL의 1x PBS로 세포를 두 번 세척하여 과도한 calcein AM 염료를 제거합니다.
5. 이와 동시에 15mL 멸균 원심분리 튜브에서 160 x g의 NK92MI 세포를 3분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 5mL의 1x PBS로 한 번 세척하고 5mL의 NK92MI 세포 배지에 재현탁합니다.
6. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 calcein AM 표지 SK-HEP-1 세포 및 NK92MI 세포를 계수합니다.
7. NK 세포 배지에서 1 x 10⁵ cells/mL에서 배양 배지의 SK-HEP-1 세포와 1 x 10⁶ cells/mL에서 NK92MI 세포를 재현탁합니다.
8. 96 웰 플레이트의 3중 웰에서 NK92MI 세포(effector cell) (1 x 10⁵/100 μL/well) (1:10 target: effector ratio)가 있는 플레이트 calcein AM 표지 SK-HEP-1 세포(타겟 세포)(1 x 10⁴/100 μL/well).
9. 96웰 플레이트를 37°C의 95% 공기와 5% CO₂의 분위기에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 10배 배율로 형광 현미경을 사용하여 calcein AM 표지 세포의 형광 이미지를 캡처합니다. 각 처리 조건에 대해 각 반복실험의 서로 다른 필드를 10개 이상 캡처합니다.
10. 각 복제에 대해 10개의 이미지를 무작위로 선택하고 NK92MI 세포가 있거나 없는 상태에서 배양된 칼세인 AM 양성 표지 표적 세포를 계산합니다. 아래 공식을 사용하여 % 세포 독성을 계산합니다..
    
    메모: 대조군으로는 NK92MI 세포가 없는 표적 세포와 완전 용해된 표적 세포를 완전 용해 대조군으로 사용합니다. 완전한 용해를 위해 세포를 0.5% Triton X-100에서 1시간 동안 배양합니다(200μL 배양 배지 중 5% Triton X-100 20μL).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
칼세인 AM 염료	시그마-알드리치	17783
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965-092
소 태아 세럼	지브코	26140079
호스 세럼	지브코	16050114
NK92MI 셀	증권 시세	CRL-2408
인산염 완충액 식염수(PBS)	시그마-알드리치	P4417
SKHEP-1 세포	증권 시세	HTB-52
트립신 EDTA 용액	지브코	25200056

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