화학요법 자극에 대한 반응으로 자연살해세포(Natural Killer Cell Migration in Response to Chemotactic Stimuli) 측정

1. NK 세포 이동 분석

1. 15mL 멸균 원심분리 튜브에서 160 x g에서 3분 동안 NK92MI 세포와 원심분리 세포를 성장시킵니다.
2. 5mL의 1x PBS로 세포 펠릿을 두 번 세척하고 3mL의 무혈청 NK92MI 세포 배지에 세포를 재현탁합니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 NK92MI 세포를 계수합니다.
3. 플레이트 NK92MI 셀(2.5 x 10,⁵ 셀/100 μL/웰)을 트랜스웰 투과성 챔버(직경 6.5mm, 인서트 5μm 및 공극 크기 5μm)의 상부 격실에 배치.
4. 하단 챔버에 NK 세포 화학유인 특성(예: 컨디셔닝 배지, 케모카인, 사이토카인)을 테스트할 물질을 포함하는 무혈청 배지 0.6mL를 추가합니다.
   메모: 컨디셔닝 배지를 준비할 때 이동 분석에서 혈청 단백질의 간섭을 제거하기 위해 혈청을 추가하지 않은 감소된 혈청 배지를 사용합니다.
5. 24-투과성 챔버를 37°C에서 4시간 동안 배양합니다. 4시간 후, 하단 챔버에서 비부착성 및 이동된 NK92MI 세포를 채취하여 추가 분석을 위해 FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting) 튜브로 옮깁니다.
   메모: 배양 시간은 표적 세포의 유형뿐만 아니라 표적 세포에서 생성되는 케모카인의 양과 동역학에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 이 시간은 각 세포 유형, 케모카인 및 실험에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다.
6. 유세포 분석을 위해 미리 결정된 수의 카운팅 비드를 50μL 부피로 마이그레이션된 NK 세포를 포함하는 각 튜브에 추가합니다. 자동화된 FACS 기반 세포 계수가 가능한 유세포 분석기를 사용하여 300 μL/well cell suspension의 부피를 평가합니다.
   메모: 실험 변동성을 최소화하기 위해 일정한 수의 비드가 사용되도록 하기 위해 사용하기 전에 매번 유세포 분석을 위해 계수 비드를 철저히 혼합하거나 와류로 혼합합니다. 정확도를 유지하기 위해 카운트 비드와 함께 역 피펫팅을 사용하는 것이 좋습니다. 유세포 분석을 위해 NK 세포와 카운팅 비드만 FACS 분석 control로 사용합니다. 저자는 최소 10,000개의 구슬 + NK 세포를 결합할 것을 권장하며, 이 양은 효과가 좋습니다. 그러나 이 숫자는 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서 beads + NK cell의 조합 개수는 각 실험 유형에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한 통계적으로 유의미한 결과를 얻고 서로 다른 세포 수 간의 변동성을 설명하기 위해 생물학적 삼중체를 사용하여 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
7. 다음 공식을 사용하여 마이그레이션된 NK92MI 셀의 절대 수를 계산합니다.
   
   여기서 A = 세포 수, B = 비드 수, C = 로트의 할당된 비드 수(유세포 분석을 위한 카운팅 비드 수/50μL, 이 예에서는 49,500), D = 샘플 부피(μL).
   메모: 유세포분석을 위해 50 μL의 카운팅 비드를 사용하여 300 μL의 시료 부피(마이그레이션된 세포)를 FACS 분석에 사용하는 경우, 마이그레이션된 세포의 절대 수 = 1,700 세포/3,300 비드 이벤트 x 49,500 비드/300 μL = 84.975 세포/μL. 샘플이 희석되거나 다른 부피의 FACS 계수 비드가 사용되는 경우 계산을 수정해야 합니다.