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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 보체 및 표적 박테리아 준비
- 아기 토끼 보체 (BRC)
준비
참고: 보체 로트 선택에 대한 자세한 기준은 여기에서 확인할 수 있습니다: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- 얼어붙은 BRC를 구하고 흐르는 찬물로 해동합니다. 완전히 해동될 때까지 ~10-20분마다 BRC를 물리적으로 혼합합니다. BRC에 동결-해동 주기를 반복하지 마십시오.
- BRC가 해동되는 동안 1.5mL, 5mL 또는 15mL 원심분리 튜브에 라벨을 부착합니다. 라벨이 붙은 튜브를 얼음 위에 올려 미리 식힙니다. 적절한 부피의 BRC를 사전 냉각된 원심분리기 튜브에 부분 표본으로 주입합니다(주입 후 즉시 각 튜브를 얼음에 다시 넣습니다). 부분 표본은 냉동고에서 ≤ -70 °C에서 보관하십시오.
메모: 각 분석 플레이트에 약 1mL의 보체가 필요합니다. 보체 부분 표본은 일회용이며 분석 레이아웃에 적합한 부피로 분주해야 합니다.
- 가열불활성화 BRC를 준비하려면 활성 BRC의 부분 표본 하나를 해동합니다. 56°C의 수조를 준비합니다. BRC가 완전히 해동된 후 수조로 옮기고 30분 동안 배양합니다.
- 배양 후 수조에서 열 비활성화 BRC를 제거하고 실온(RT)에서 10-15분 동안 냉각시킵니다. 격렬하게 혼합하고 ~150 μL에서 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브를 분취합니다. 부분 표본은 ≤ -10 °C에서 보관하십시오.
- 표적 박테리아 스톡
준비
참고: 아래 절차는 표적 박테리아 스톡의 분취액 48개를 준비하는 데 사용됩니다. 더 많은 부분 표본이 필요한 경우 프로토콜을 확장할 수 있습니다.
- 냉동실에서 박테리아 마스터 스톡 바이알을 제거하고 얼어붙은 박테리아 표면을 긁어내어 바이알에서 혈액 한천 플레이트에 소량의 얼음을 제거합니다. 즉시 마스터 스톡 바이알을 냉동실에 다시 넣으십시오.
- 이 작은 박테리아 스톡 분취액을 혈액 한천 플레이트에 줄무늬를 만들고 플레이트 뚜껑으로 덮습니다. 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 밤새 플레이트를 거꾸로 배양합니다.
- ~10개의 분리된 매끄러운 콜로니를 30mL의 LB 육수가 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다. 배양 육수가 OD600이 ~0.6-0.7이 될 때까지 37°C에서 3-5시간 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 배양액의 상위 12.5mL를 수확하고 새로운 50mL 튜브로 옮깁니다. 탁상용 마이크로 원심분리기를 사용하여 15,000 x g에서 2분 동안 배양을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 15% 멸균 글리세롤-LB 25mL에 다시 현탁시킵니다.
- 잘 섞어 0.5mL 분취액을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브(~48개 튜브)에 분주합니다. 부분 표본은 냉동실에서 ≤ -70 °C에서 보관하십시오.
- 사용하기 전에 응집 테스트를 사용하여 박테리아 특성을 확인하십시오.
- 표적 박테리아 스톡에 대한 최적 희석 계수 결정
참고: 표적 박테리아 스톡의 각 배치는 LB 플레이트에서 ~120 CFU/spot을 생성하는 데 필요한 희석을 결정하기 위해 분석 조건에서 적정해야 합니다.
- 마이크로타이터 플레이트(Dilution Plate)를 구하고 135μL의 분석 버퍼를 웰 1A에 추가합니다.120μL의 분석 버터를 웰 1B-1H에 추가합니다.
- 냉동실에서 냉동 표적 박테리아 바이알을 꺼내 실온에서 해동합니다. 웰 15A에 해동된 박테리아 스톡을 15ul 첨가하여 박테리아 스톡을 10배 희석합니다.
- 30μL의 박테리아 용액을 웰 1A에서 웰 1B로 옮겨 5배 연속 희석을 수행합니다. 웰 1H까지 5배 연속 희석을 계속하여 총 8회 희석합니다(1:10, 1:50, 1:250, 1:1 250, 1:6 250, 1: 31 250, 1: 156 250, 1:781 250).
- 다른 마이크로타이터 플레이트(분석 플레이트)를 가져와 분석 플레이트의 열 1과 2에 있는 모든 웰에 20μL의 분석 버퍼를 추가합니다.
- 희석 플레이트의 1열에 있는 각 웰에서 10μL의 희석된 박테리아를 분석 플레이트의 1열과 2열에 있는 해당 웰로 옮깁니다.10μL의 박테리아는 희석 플레이트의 웰 1A에서 분석 플레이트의 웰 1A 및 2A 등으로 전달됩니다.
- Control A 및 Control B에 대해 아래의 Serum Bactericidal Assay(SBA)에 설명된 대로 3.6-3.12 단계를 계속합니다.
- 플레이트를 얼음에서 배양한 후 8개의 피펫 팁이 있는 멀티채널 피펫을 사용하여 컬럼 1의 웰에서 LBA 플레이트로 10μL를 찾아냅니다. 또한 컬럼 2의 웰을 LBA 플레이트로 이동합니다.
- 아래 3.14-4.6단계에서 설명된 대로 분석을 계속합니다.
- Control B에서 ~120 CFU/spot을 생성하는 박테리아 희석을 측정하면 이 희석액이 분석에 사용됩니다.
2. 혈청 살균 분석(SBA)
참고: 아래에 설명된 절차는 하나의 분석 플레이트에 대한 것이지만 분석 플레이트의 수를 늘릴 수 있습니다.
- 56°C 수조에서 샘플을 30분 동안 배양하여 테스트 샘플을 열 비활성화
메모: 테스트 샘플은 내인성 보체 활성을 제거하기 위해 테스트 전에 열을 비활성화해야 합니다. 이는 분석 전에 수행할 수 있으며 불활성화한 샘플은 테스트할 때까지 4°C에서 다시 냉동하거나 보관할 수 있습니다.
- 분석 플레이트를 가져와서 20μL의 분석 버퍼를 행 A에서 G까지의 열 1에서 12에 추가합니다. 20μL의 분석 버퍼를 행 H의 열 1과 2에 추가합니다(표 1 참조).
- 각 테스트 샘플의 30μL를 분석 플레이트의 H 행에 중복으로 로드합니다. 예를 들어, 샘플 1 30μL를 웰 3H 및 4H에 분배하고 샘플 2 30μL를 웰 5H 및 6H 등에 분배합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 테스트 샘플의 3배 연속 희석을 수행합니다.
- 웰 3H-12H에서 샘플 10 μ를 제거하고 G 열의 해당 웰로 옮기고 8-10회 위아래로 피펫팅하여 샘플을 잘 혼합합니다.
- 그런 다음 웰 3G-12G에서 10 μ 제거하고 F열의 해당 웰로 옮기고 잘 혼합합니다.
- 이러한 직렬 희석을 행 A까지 계속합니다. A 행의 웰을 혼합한 후 모든 웰에 20μl.
이 포함되도록 웰 3A-12A에서 10μl를 제거하고 버립니다.
메모: 총 80μL의 분석 부피에 20μL의 혈청이 사용되기 때문에 분석에서 4배의 추가 희석이 있습니다. 이 희석은 SBA 역가를 계산하는 동안 혈청 희석에 4를 곱하여 고려해야 합니다. 예를 들어, 1:2의 시작 희석을 사용하는 경우 테스트 중인 실제 희석은 1:8입니다.
- 냉동 Target Bacteria Stock 바이알 1개를 제거하고 실온에서 해동합니다. 사전 결정된 최적 희석 계수에 따라 20mL의 Assay Buffer에 박테리아를 희석합니다(이 희석 계수는 섹션 1.3에서 결정됨). 멀티채널 피펫을 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 희석된 박테리아 10μL를 추가합니다.
- 냉동 BRC 바이알 1개와 냉동 열 비활성화 BRC 바이알 1개를 제거하고 흐르는 찬물로 실온에서 해동하거나 공기를 불어넣는 생물 안전 캐비닛의 창살에 올려 빠르게 해동합니다.
- 열 비활성화 BRC의 20% 용액을 준비합니다. 100μL의 열 비활성화 BRC와 400μL의 분석 버퍼를 혼합합니다. 이 20% 열 비활성화 BRC 용액 50μL를 컬럼 1(Control A well)의 모든 웰에 추가합니다.
메모: 열 비활성화 BRC는 분석에서 NSK(Non-Specific killing)를 모니터링하기 위한 대조군으로 사용됩니다.
- 천연 BRC의 20% 용액을 준비합니다. 1mL의 네이티브 BRC와 4mL의 분석 버퍼를 혼합합니다. 이 혼합물 50μL를 2열에서 12열까지의 모든 웰(대조군 B 및 테스트 샘플 웰)에 추가합니다.
메모: 반응 혼합물 내 BRC의 최종 농도는 12.5%입니다.
- 플레이트 셰이커에서 10-15초 동안 부드럽게 흔들어 어세이 플레이트를 간단히 혼합하거나 멀티채널 피펫을 사용하여 위아래로 8회 피펫팅하여 혼합합니다.
- 분석 플레이트를 37°C 미생물 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다(흔들지 않음).
- 뚜껑을 제거하고 플레이트를 위로 향하게 하여 생물 안전 캐비닛에 40-60분 동안 올려 LBA 플레이트 2개를 건조시킵니다.
- 2시간 배양이 완료되면 Assay Plate를 젖은 얼음으로 옮기고 10-20분 동안 배양하여 반응을 중지합니다.
- 12채널 피펫을 사용하여 H행의 웰과 반응 혼합물의 스폿 플레이트 10μL를 LBA 플레이트의 바닥에 혼합합니다. 즉시 플레이트를 기울이고 반점이 ~ 1.5-2cm 동안 흐르도록하십시오. G, F 및 E 행에 대해 이 절차를 반복하여 LBA 플레이트의 이전 행 위에 찾습니다. 행 E, F, G, H는 하나의 LBA 플레이트에서 발견되고 행 A, B, C, D는 동일한 방식으로 두 번째 LBA 플레이트에서 발견됩니다(그림 1 참조).
- 용액이 LBA 플레이트에 흡착될 때까지 실온에서 LBA 플레이트를 배양합니다(10-15분). LBA 플레이트에 뚜껑을 덮고 LBA 플레이트를 미생물 인큐베이터에 거꾸로 놓고 하룻밤(~16-18시간) 배양합니다. Shigella flexneri 2a 및 3a를 29 ° C에서 배양하고 S. sonnei를 26 ° C에서 배양하십시오 .
메모: 이러한 온도는 콜로니 카운터9에 의한 정확한 계수에 적합한 크기를 가진 더 작은 "마이크로 콜로니"를 생성합니다.
- 하룻밤 배양 후 각 LBA 플레이트에 100 μg / mL TTC 및 0.1 % NaN3을 포함하는 25 mL의 오버레이 한천 (~ 55 ° C)을 첨가합니다.
- LBA 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 배양하여 살아남은 박테리아가 붉은색을 띠도록 합니다(아래 그림 1 참조).
- 디지털 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영하고 NIST의 NICE(Integrated Colony Enumerating Software)가 설치된 컴퓨터로 이미지를 전송합니다(그림 2.
참조
메모: NICE 콜로니 카운팅 소프트웨어는 무료로 사용할 수 있습니다. 자세한 내용 및 설치 지침은 재료 목록을 참조하십시오.
표 1: 분석 플레이트 레이아웃. 열 1과 2에는 보수 제어 웰이 포함되어 있습니다. Control A는 열 1에 위치하며 SBA 완충액, 박테리아 및 열 비활성화 보체를 포함하는 열 비활성화 보체 대조군입니다. Control B는 2열에 위치하며 SBA 완충액, 박테리아 및 보체를 포함하는 활성 보체 대조군입니다. 3-12열에는 혈청 샘플이 포함되어 있습니다. 각 샘플은 H행에서 A행까지 3겹으로 순차적으로 희석되어 복제되어 실행됩니다
개
개
개
개
개
분
세
세
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| ᅡ | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 | 희석 8 |
| 비 | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 | 희석 7 |
| 씨 | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 | 희석 6 |
| 디 | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 | 희석 5 |
| E | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 | 희석 4 |
| 에프 | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 | 희석 3 |
| 지 | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 | 희석 2 |
| H | 컨트롤 A | 컨트롤 B | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 | 희석 1 |
| | | 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | 샘플 4 | 샘플 5 |
