복막 대식세포(Peritoneal Macrophage)에 의한 Apoptotic Thymocytes의 Efferocytosis 분석

초록

출처: Zhen, Y. et al., 대식세포에 의한 흉선세포자멸사의 실험적 분석. J. Vis. 특급. (2019년)

이 동영상은 형광 현미경으로 세포사멸 마우스 흉선세포의 복막 대식세포 매개 발포구를 분석하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CFSE 표지 자가사멸 흉선세포의 제조

2마리의
1. 순진한 C57/B6 마우스를 CO₂ 흡입으로 10분 동안 안락사시키고 흉강을 열도록 해부하고 10mL의 배지를 포함하는 조직 배양 페트리 접시에 구부러진 가는 끝 집게로 흉선을 제거(당겨RPMI1640.
2. 현미경 슬라이드의 젖빛 두 끝 부분에 대해 전체 흉선을 분쇄한 다음 100μm 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
3. 10mL 흉선 현탁액을 50mL 튜브에 넣고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
4. 상층액을 제거하고 40mL의 1x PBS에 재현탁한 다음 혈구계로 세포 수를 계수합니다.
5. 300 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
6. 최대 2 x 10⁸ 세포가 있는 단일 세포 현탁액으로 50 mL 튜브에 1x PBS 20 mL에 재현탁합니다(2 x 10⁸ 세포 이상인 경우 다른 50 mL 튜브에서 1 x PBS의 다른 20 mL에 나머지 세포를 재현탁).
7. 40 μL의 CFSE 원액(2.5 mM)을 1x PBS 20 mL에 피펫팅하여 별도의 50 mL 튜브에 1x PBS의 동일한 부피(20 mL)로 5 μM의 CFSE를 만들고 튜브를 2 - 3회 뒤집어 잘 혼합합니다.
8. 1.7단계의 CFSE 20mL를 1.6단계의 세포 현탁액 20mL에 추가합니다(CFSE의 최종 농도는 이제 2.5μM임).
   메모: 20mL 세포 현탁액마다 20mL CFSE 튜브가 필요합니다.
9. 세포와 CFSE 혼합물 튜브를 2 - 3회 뒤집고 혼합물을 실온의 어두운 곳에서 최대 2분 동안 배양한 다음 10mL의 열 비활성화 호스 혈청을 첨가하여 반응을 중지합니다.
10. 50mL 튜브 혼합물을 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    메모: CFSE 라벨링이 성공하면 세포 펠릿이 연한 노란색이 됩니다.
11. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 40mL의 1x PBS에 재현탁시키고 혈구계로 세포 수를 계수합니다.
12. 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
13. 세포 펠릿을 40mL의 배지RPMI1640 다시 세척합니다.
14. 상층액을 제거하고 100mm 조직 배양 접시에서 7 x 10⁶ cells/mL의 농도로 RPMI1640 조직 배양 배지(RPMI1640, 20mM HEPES, 10% FBS(열 불활성화), 20mM 글루타민 및 1x Pen/Strep)으로 세포를 재현탁합니다.
    메모: 더 많은 세포를 얻을 수 있는 경우, 별도의 100mm 조직 배양 접시가 필요합니다.
15. 1μM의 최종 농도에서 세포 현탁액 배양액에 스타우로스포린을 추가하고 5%_CO2가 공급되는 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.

2. 복막 대식 세포의 준비

1. 2마리의 C57B6 마우스(또는 실험실의 유전자 조작 마우스)를 0일차에 3% 숙성된 티오글리콜레이트 1mL를 복강내 주입합니다.
2. 1.1단계에서와 같이 5일째에 쥐를 안락사시키고 복부 피부를 자르고 껍질을 벗기지만 복막은 그대로 둡니다. 18G 바늘에 부착된 10mL 주사기를 사용하여 10mL의 세척 버퍼(RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA)를 복강으로 빠르게 밀어 복강을 세척합니다.
3. 동일한 바늘/주사기로 세척 버퍼를 천천히 회수하고 세척 버퍼를 50mL 튜브에 수집합니다.
4. 1x PBS로 복막 간을 두 번 세척하고, 조직 배양 배지에서 복막 대식세포RPMI1640 2 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 재현탁하고, 24웰 플레이트의 각 웰에 500 μL를 분취합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 2시간 동안 그대로 둡니다.
5. 부유 세포를 흡인하고 500μL의 신선한 배양 배지로 두 번 교체하여 제거합니다.
6. 선택적으로, 그림 범례에 표시된 농도의 TAM 수용체 티로신 억제제인 RXDX-106을 대식세포 배양의 각 웰에 추가하고 2시간 동안 더 배양합니다.

3. 복막 대식세포와 세포사멸세포의 공동 배양

1. 1단계에서 세포사멸 흉선세포를 수집하고 배지로 3회 세척RPMI1640. 이 단계에서 Annexin V/7-AAD 키트를 사용하여 세포사멸 유도의 효율을 측정할 수 있습니다.
2. 실험 배열에 따라 프로토콜 #2에서 대식세포 배양의 각 웰에 0 - 12 x 10⁶ 세포(500μL 배지)를 분배합니다(예: 그림 1 참조). 이렇게 하면 24웰 플레이트의 각 웰에서 전체 배양 부피가 1mL가 됩니다. 세포사멸세포(apoptotic thymocytes)를 추가하기 직전에 차단 항체를 배양액에 추가합니다.
3. 세포 혼합물을 5%_CO2가 공급된 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
4. 배양물의 각 웰을 1x PBS(500μM EDTA 함유)로 두 번 세척하여 자유 부유 세포사멸 세포를 제거합니다.
5. 이 단계에서 플레이트로 결합된 대식세포를 CD11b-PE로 염색합니다.
   1. 플레이트에 결합된 대식세포를 염색 완충액(1x PBS, 1% BSA)으로 한 번 세척합니다.
   2. 2 μL CD11b-PE를 함유한 200 μL의 염색 완충액을 각 웰에 추가합니다.
   3. 플레이트를 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
   4. 얼룩 완충액으로 플레이트의 각 웰을 세 번 씻습니다.
   5. 200μL의 염색 완충액을 추가하고 형광 현미경에서 이미지 분석을 위해 플레이트를 진행합니다.

결과

그림 1. 복막 대식세포에 의한 apoptotic thymocytes의 phagocytosis 비율. 세포사멸 흉선세포는 1μM의 스타우로스포린으로 4시간 동안 배양하여 유도하고, 그림 패널에 나타난 비율로 대식세포 배양에 첨가하였다: (A) 1:0; (나) 1:1; (다) 1:2; (라) 1:4; (마) 1:6; (바) 1:8; (사) 1:10; (H) 1:12. 데이터는 유세포 분석기로 획득했습니다. 식세포 대식세포의 비율은 유세포 분석기와 관련된 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ack 용해 버퍼	지브코	A10492
부속서 V/7-AAD	BD 파밍겐	559763
Anti-Mer 항체	R&D 시스템	바프591
CD11b-PE (클론 M1/70)	BD 파밍겐	553311
증권 시세	인비트로젠	C1157 (영문
디엠소	시그마-알드리치	D-2650
EDTA (0.5 mM)	지브코	제15575-020
FACS 튜브	BD 바이오사이언스	352017
호스 세럼 (열 비활성화)	인비트로젠	26050088
PBS, 1배	코 닝	21040CV
RPMI-1640	코 닝	10040CV
RXDX-106	Selleck 화학 물질	CEP-40783
스타우로스프린 (100mg)	피셔 사이언티픽	BP2541-100	100mg에 DMSO 214.3ml를 첨가하여 1mM 스타킹 용액을 만듭니다