In Vitro Stimulation and Visualization of Macrophage Extracellular Traps

초록

출처: Zhang, Y., et al. 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포외 트랩 방출의 체외 자극 및 시각화. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 TNF-알파, PMA 및 HOCL과 같은 다양한 염증 자극을 사용하여 인간 단핵구에서 파생된 대식세포의 대식세포 외 트랩(MET)의 체외 자극을 보여줍니다. 이 비디오는 또한 시각화를 위한 MET의 SYTOX 염료 염색 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. HMDM의 편광

1. 멸균 조건에서 완전한 RPMI-1640 배양 배지에 인터페론 γ(IFNγ; 20ng/mL) 및 지질다당류(LPS, 1μg/mL)를 첨가하여 M1 프라이밍 배지를 준비합니다. 전체 RPMI-1640 배양 배지에 인터루킨 4(IL-4; 20 ng/mL)를 첨가하여 M2 프라이밍 배지를 준비합니다.
2. 무균 상태에서 섹션 1에 설명된 대로 파종 및 배양된 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDM)가 포함된 조직 배양 플레이트 웰에서 배지를 흡인합니다.
3. PBS 분취액 1mL를 사용하여 멸균 PBS(37°C로 예열)로 셀이 포함된 웰을 3x 조심스럽게 세척합니다.
4. HMDM을 포함하는 각 웰에 M1 또는 M2 프라이밍 매체 1mL를 추가합니다(둘 중 실험에 적합한 것).
5. 세포 배양기에서 5% CO₂가 있는 상태에서 37°C에서 48시간 동안 세포를 배양합니다.

2. MET 방출을 유도하기 위한 HMDM 자극

1. 무균 상태에서 대식세포 세포외 트랩 MET 방출(실험에 적합한 것)의 다양한 자극제를 포함하는 배양 배지를 완전한 RPMI-1640 배지(PMA(25nM), 인간 재조합 TNFα(25ng/mL) 또는 인간 재조합 IL-8(50ng/mL))에 준비합니다.
2. 차아염소산, HOCl 자극 실험의 경우, 세포에 첨가하기 직전에 HBSS(37°C로 예열)에서 HOCl(200μM)을 준비합니다. HOCl이 완전한 셀 매체에서 준비되지 않았는지 확인합니다.
   메모: HOCl의 원액 농도는 292nm 및 pH = 11⁶에서 용액의 UV 흡광도를 측정하고 350M-1cm-1의 흡광 계수를 사용하여 정량화합니다.
3. 섹션 2에 설명된 분극 처리 후 각 웰에서 세포 배지를 흡인하고 37°C로 예열된 멸균 PBS(PMA, TNFα 및 IL-8의 경우) 또는 HBSS(HOCl의 경우)의 1mL 분취액으로 세포를 3x 조심스럽게 세척합니다.
4. PMA, TNFα 또는 IL-8 실험의 경우: 최종 세척 단계에서 PBS를 제거한 후 PMA, TNFα 또는 IL-8을 포함하는 전체 배지 1mL를 추가합니다.
5. TNFα를 사용한 실험의 경우, 세포 배양기에 5% CO2가 있는 상태에서 37°C에서 6시간 동안 세포를 배양합니다. PMA 및 IL-8 실험의 경우, 세포 인큐베이터에서 5% CO₂가 존재하는 상태에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
6. HOCl을 사용한 실험의 경우 최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후 HBSS에 HOCl 1mL를 추가합니다. 그런 다음 세포 배양기에서 5%_CO2가 있는 상태에서 37°C에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
   1. 세포 상등액을 조심스럽게 흡인하고 2.3단계에서 설명한 대로 HBSS 분취량 1mL로 세포를 3배 세척합니다.
   2. 최종 세척 단계에서 HBSS를 제거한 후 완전한 RPMI-1640 배양 배지 1mL를 추가합니다. 그런 다음 세포 배양기에서 5%_CO2가 있는 상태에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.

3. 생세포 배양에서 MET의 시각화

1. HBSS에서 SYTOX 녹색 염료를 40μM 농도로 준비합니다.
2. MET 방출을 유도하기 위해 섹션 2에 설명된 처리가 끝날 때 HMDM을 함유한 각 웰에 25μL의 40μM 염료를 직접 첨가합니다.
3. 어두운 곳에서 5분 동안 실온(RT)에서 세포를 배양합니다.
4. 이미징을 위해 도립 형광 현미경의 현미경 스테이지에 있는 조직 배양 웰에 HMDM을 배치합니다.
5. 현미경 절차
   1. 고해상도 컬러 디지털 카메라와 함께 설치된 광역 스펙트럼 형광 광원, 명시야 광원 및 도립 현미경을 켭니다(재료 표 참조).
   2. 조직 배양 웰 내에 포함된 녹색 염색 샘플의 이미징을 위해 녹색 형광(여기 = 504nm, 방출 = 523nm)을 위해 필터 휠을 "숫자 2" 위치로 돌립니다.
   3. 5x 대물렌즈를 사용하여 거친 초점으로 이미지의 초점을 맞춘 다음 현미경의 미세 초점 손잡이로 이미지가 선명하고 선명하며 초점이 맞춰질 때까지 view현미경 접안렌즈를 통해 view.
   4. 현미경을 카메라 모드로 전환합니다.
   5. 관련 소프트웨어를 시작합니다.
   6. 소프트웨어에서 캡처 탭을 선택합니다.
   7. 재생 버튼을 클릭하여 사전view 이미지를 선택하고 이미지가 소프트웨어 사전에서 선명하고 선명하며 초점이 맞춰질 때까지 현미경의 미세 초점 노브를 조정합니다.view 창.
   8. 캡처 버튼을 클릭합니다.
      메모: 캡처된 이미지는 함께 제공되는 소프트웨어에 자동으로 표시됩니다.
   9. 소프트웨어 내에서 File(파일) | 필요한 이미지 파일 형식으로 저장합니다.
   10. 현미경에서 명시야 이미징을 위해 필터 휠을 "숫자 5" 위치로 돌리고 3.5.2–3.5.9단계를 반복하여 해당 명시야 이미지를 얻습니다.
   11. 후속 이미지 획득에 필요한 경우 3.5.2–3.5.10 단계를 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
120Q 브로드 스펙트럼 형광 광원	EXFO Photonic Solutions, 토론토, 캐나다	X-CITE 시리즈
코닝 CellBIND 멀티플 웰 플레이트(12웰)	시그마-알드리치	CLS3336	세포 배양용
차아염소산(HOCl)	시그마-알드리치	320331	MET 자극용
인터페론 감마	써모 피셔	PMC4031	M1 프라이밍용
인터루킨 4	통합 과학	릴-4	M2 프라이밍용
인터루킨 8	밀테닐 바이오텍	Tel.: 130-093-943	MET 자극용
L-글루타민	시그마-알드리치	59202씨	배양 배지에 추가됨
Olympus IX71 도립 현미경	올림푸스, 도쿄, 일본
Phorbol 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)	시그마-알드리치	P8139	MET 자극용
인산염 완충 식염수(PBS)	시그마-알드리치	D5652	세척 단계용
RPMI-1640 미디어	시그마-알드리치	R8758	세포 배양용
사이톡스 그린	생명 기술	S7020	MET visulaization의 경우
TH4-200 명시야 광원	올림푸스, 도쿄, 일본		X-CITE 시리즈
종양 괴사 인자 알파	론자	300-01ᄀ-50	MET 자극용