PMN에 대한 박테리아 세포외 단백질 매개 세포 독성에 대한 분석

초록

출처: Dankoff, J. G., et al. 인간 다형성핵 백혈구에 대한 황색포도상구균의 세포 독성 정량화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 병원성 박테리아인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 분리한 인간 다형성핵 백혈구(PMN)에서 생성된 단백질의 세포 독성을 조사하기 위한 분석을 보여줍니다. 분비된 세포독성 단백질은 PMN 세포막에 공극을 형성하여 세포 사멸을 시작합니다. 프로피듐 요오드화물을 사용하여 죽은 세포를 염색할 때 유세포 분석법을 수행하여 죽은 세포를 정량화하고 박테리아의 세포 독성을 평가합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 인간 다형성 핵 백혈구의 정제 및 인간 혈청의 분리

참고: 모든 시약은 시중에서 판매되는 내독소 검출 키트를 사용하여 내독소의 존재 여부를 정기적으로 확인해야 하며 원치 않는 PMN의 프라이밍을 방지하기 위해 <25.0pg/mL의 내독소를 포함해야 합니다.

1. 3% 덱스트란-0.9% NaCl(w/v) 50mL, 0.9% NaCl(w/v) 35mL, 1.8% NaCl(w/v) 20mL, 1.077g/mL 밀도 구배 용액 12mL, 주입 또는 관개 등급 물 20mL를 실온에 가져옵니다.
2. 인간 혈청을 분리하기 위해 항응고제 없이 갓 채취한 인간 혈액 4mL를 15mL 유리관에 넣고 30분 동안 배양합니다. 배양 후 실온에서 10분 동안 2,000–3,000 × g에서 샘플을 원심분리합니다. 상부 혈청층을 새로운 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브에 옮기고 얼음 위에 놓습니다.
3. 갓 채취한 헤파린화된(1000 units/mL) 전혈 25mL를 실온 3% 덱스트란-0.9% NaCl(1:1 비율) 25mL를 2개의 복제 50mL 코니컬 원심분리 튜브(튜브당 총 부피 50mL)에 결합합니다. 각 50mL 코니컬 튜브를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
4. 실온에서 배양하면 두 개의 별도 레이어가 나타납니다. 각 덱스트란-혈액 혼합물의 최상층을 새로운 50mL 코니컬 튜브로 옮기고 450 x g에서 브레이크가 낮거나 없는 실온에서 10분 동안 원심분리합니다.
5. 두 상층액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 폐기합니다. 각 세포 펠릿을 실온 0.9% NaCl 2mL에 부드럽게 재현탁시키고, 재현탁된 펠릿을 단일 50mL 원뿔형 튜브에 결합한 다음 나머지 0.9% NaCl(최종 부피 35mL)을 추가합니다.
6. 핸드 피펫을 사용하여 1.077g/mL 밀도 구배 용액의 실온 10mL를 세포 현탁액 아래에 조심스럽게 깔아줍니다. 450 x g에서 30분 동안 실온에서 브레이크가 낮거나 없는 상태로 회전합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 부드럽게 흡입합니다. 상등액에는 앞서 설명한 바와 같이 수집할 수 있는 말초 혈액 단핵 세포가 포함됩니다.
7. 세포 펠릿을 실온의 물 20mL에 재현탁하여 적혈구를 용해시킵니다. 튜브를 30초 동안 흔들어 부드럽게 섞습니다. 적혈구의 용해는 탁도의 뚜렷한 감소를 동반합니다.
8. 즉시 20mL의 1.8% NaCl(실온[RT])과 원심분리 샘플을 450×g으로 실온에서 10분 동안 추가합니다.
   메모: PMN 수율을 최대화하고 PMN 용해 및/또는 활성화를 방지하기 위해 적혈구 용해 후 PMN이 물에 혼자 남아 있는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
9. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입합니다. 세포 펠릿을 RT RPMI 1640 배지 2mL에 부드럽게 재현탁시키고 얼음 위에 놓습니다.
10. 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 정제된 PMN을 얼음처럼 차가운 RPMI로 1 x 10⁷ cells/mL의 농도로 재현탁하고 얼음 위에 보관합니다.
11. 100 μL의 정제된 PMN(1 x 10,⁶ 세포)을 2개의 복제 유세포 분석 튜브에 1 μL의 프로피듐 요오드화물 염색을 함유한 300 μL의 얼음처럼 차가운 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)를 결합합니다. 원형질막 손상에 대한 양성 대조군을 위해 40μL의 0.5% Triton X-100 용액을 유세포 분석 튜브 중 하나에 넣고 완전히 혼합합니다.
12. 유세포 분석을 사용하여 정제된 세포의 전방 산란, 측면 산란 및 프로피듐 요오드화물 염색(535/617 nm에서 여기/방출 최대값)을 측정합니다(그림 1).
    메모: 전방 및 측면 산란 분석은 원치 않는 림프구 및 단핵구 집단을 식별합니다. Propidium iodide는 손상된 원형질막이 있는 세포만 염색하며, propidium iodide 양성 세포 집단이 뚜렷한 정제된 PMN을 사용해서는 안 됩니다. 이러한 연구에서 정제된 PMN은 정제된 세포의 >98%와 프로피듐 요오드화물에 대해 양성으로 염색된 <5%로 구성된 경우에만 사용되었습니다.
13. 이 분석에 사용될 개별 웰을 DPBS로 희석된 100μL의 20% 분리된 인간 혈청으로 코팅하여 PMN 세포독성 분석을 위한 96웰 플레이트를 준비합니다.
    메모: PMN을 플라스틱이나 유리에 직접 도금하면 세포가 활성화됩니다. 매체만 수용하는 최소 하나의 음극 대조군 웰과 0.05% Triton X-100을 수용하는 최소 하나의 양극 대조군 웰을 포함해야 합니다.
14. 플레이트를 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 코팅된 웰을 얼음처럼 차가운 DPBS로 두 번 세척하여 과도한 혈청을 제거합니다. 플레이트를 거꾸로 가볍게 두드려 잔여 DPBS를 제거하고 얼음 위에 놓습니다.
15. 1 x 10⁷ cells/mL에서 100 μL의 정제된 human PMN을 코팅된 각 well(1 x 10⁶ PMN/well)에 부드럽게 첨가합니다. PMN이 최소 5분 동안 얼음 위에서 플레이트를 배양하여 우물에 정착할 수 있도록 합니다. 각 웰에 세포가 고르게 분포할 수 있도록 플레이트의 수평을 유지하고 원치 않는 PMN의 활성화를 방지하기 위해 얼음 위에 두십시오.

2. 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 S. aureus 세포외 단백질의 세포 독성 분석

1. S. aureus를 37°C로 설정된 진탕 인큐베이터를 사용하여 트립틱 콩 육수(TSB)에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이러한 연구를 위해 별도의 150mL 삼각 플라스크에 있는 TSB 20mL에 S. aureus 균주 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S의 동결 배양물을 접종하고 250rpm에서 진탕하면서 약 14시간 동안 성장시켰습니다.
2. 새로운 배지로 하룻밤 사이에 박테리아 배양을 1:100 희석하여 S. aureus를 Subculture합니다. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달할 때까지 37°C에서 흔들면서 배양합니다.
   메모: 이러한 실험을 위해 150mL 삼각 플라스크에 20mL의 트립틱 콩 육수에 200μL의 하룻밤 배양 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S를 접종하고 37°C에서 250rpm으로 5시간 동안 진탕하면서 배양했습니다.
3. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달했을 때, 계대배양된 황색포도상구균 1mL를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 5,000 × g으로 원심분리합니다.
4. 원심분리 후 상층액을 3mL 주사기로 옮깁니다. 상층액을 0.22μm 필터를 통해 얼음 위의 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 통과시킵니다.
5. S. aureus.
   배양에 사용되는 얼음처럼 차가운 배지로 상층액의 연속 희석을 수행합니다. 메모: 표시된 실험을 위해 USA300 및 USA300ΔsaeR/S의 상등액은 얼음처럼 차가운 TSB로 4회 연속 1/2 log 희석을 거쳤습니다.
6. 1.15단계에서 상등액 샘플 또는 배지 단독(음성 및 양성 대조군의 경우)을 얼음 위의 PMN이 포함된 96웰 플레이트의 개별 웰에 부드럽게 추가합니다. 이러한 실험을 위해 10μL의 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S 상등액 샘플을 각 웰에 첨가했습니다. 우물에 상층액을 분배하고 37 °C에서 배양하기 위해 부드럽게 암판을 만듭니다.
7. 원하는 시간에 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 얼음 위에 올려 놓습니다. 40μL의 0.5% Triton X-100을 positive control well에 추가합니다.
8. 각 웰에서 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음 샘플을 1μL의 프로피듐 요오드화물과 함께 300μL의 얼음처럼 차가운 DPBS를 포함하는 얼음 위의 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.
9. 유세포 분석을 사용하여 프로피듐 요오드화물 양성 PMN의 비율을 측정합니다(그림 2A)). DNA에 결합할 때 요오드화 프로피듐은 535/617 nm에서 여기/방출을 갖습니다.

결과

그림 1: 정제된 PMN의 유세포 분석 말초 혈액 단핵 세포로 의도적으로 오염된 (A) 정제된 인간 PMN 및 (B) PMN의 대표적인 유세포 분석 점도표. (C) 0.05% Triton X-100(음영 빨간색)으로 처리된 PMN과 비교하여 정제된 PMN(음영 회색)의 최소 프로피듐 요오드화물 염색(<1%)을 보여주는 대표적인 유세포 분석 히스토그램.

그림 2: S. aureus에 의해 생성된 세포외 단백질에 취한 PMN의 유세포 분석 분석.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.9% 염화나트륨 주입제, USP, 500 mL VIAFLEX 플라스틱 용기	백스터	2B1323Q (영문)	PMN 정제
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브(스냅 캡 포함)	폭스바겐	89000-044	세포 세척에 사용
1.8% 염화나트륨 용액	시그마-알드리치	S5150	PMN 정제
12x75mm 배양 튜브	폭스바겐	60818-430	유세포 분석 튜브로 사용
20%(w/w) 덱스트란	시그마-알드리치	D8802	PMN 정제
3125 핸드 탈리 카운터	추적 가능한 제품	3125CC	셀 계수용
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	폭스바겐	89039-656	디스펜싱 미디어용
Bacto Tryptic soy broth, 대두 카제인 다이제스트 배지	피셔사이언티픽	211823	세포 배양 성장용
Luer-Lok 팁이 있는 BD 일회용 주사기, 3mL	피셔사이언티픽	BD 309657	상층액 여과용
Bright-Line 혈구계	시그마-알드리치	Z359629	세포 계수 장치
DPBS, 칼슘과 마그네슘이 함유된 1x(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	코 닝	21-030-이력서	세포 세척에 사용
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어	Tel.: 17-1440-02	PMN 정제
Fisherbrand 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫	피셔사이언티픽	13-678-11E	흡입 액체용
Greiner CELLSTAR 96웰 플레이트	밀리포어 시그마	M0687	실험 샘플을 담기 위한 플레이트
OMICRON 주사기 필터	오미크론 사이언티픽	SFPV13R	상층액 여과용
프로피듐 요오드화물	써모피셔 사이언티픽	P3566	멤브레인 불침투성 DNA 염색
PYREX 브랜드 4980 삼각 플라스크	콜-파머	EW-34503-24	세포 배양 성장용
RPMI 1640, L-글루타민 제외 1X, 페놀 레드	코 닝	17-105-CV	세포를 재현하는 데 사용됩니다.
관개용 멸균수, USP	백스터	제2F7113	PMN 정제
피펫 펌프	Bel-Art 제품	F37898	흡입 액체용
트리톤 X-100	시그마-알드리치	엑스100	Membrane integrity positive control (멤브레인 무결성 양성 제어)

년 년 년 (영문) 호