포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 세포 독성 분석 : phagocytosis 후 호중구에 대한 균주

초록

출처: Dankoff, J. G. et al., 인간 다형성핵 백혈구에 대한 황색포도상구균의 세포 독성 정량화. J. Vis. 특급. (2020년)

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 식균작용 후 인간 호중구에 대한 악성 및 덜 독성이 있는 Staphylococcus aureus 균주의 세포 독성을 검출하는 분석을 시연합니다.

프로토콜

1. 식세포작용 후 human polymorphonuclear leukocytes against human polymorphonuclear leukocytes against S. aureus cytotoxicity assay

참고: 600nm(OD600)에서의 광학 밀도와 박테리아 농도로 정의된 성장 곡선은 이 분석을 시작하기 전에 S. aureus 균주를 테스트하기 위해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이러한 실험의 성공을 위해서는 하위 배양 박테리아의 OD600을 사용하여 중간 기하급수적 성장 단계에서 테스트된 각 S. aureus 균주의 동일한 농도를 일관되게 수확해야 합니다.

1. 아래에 설명된 대로 S. aureus 균주 및 하위 배양 박테리아의 야간 배양을 시작합니다.
   1. S. aureus를 37°C로 설정된 진탕 인큐베이터를 사용하여 트립틱 콩 육수(TSB)에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이러한 연구를 위해 별도의 150mL 삼각 플라스크에 있는 TSB 20mL에 S. aureus 균주 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S의 동결 배양물을 접종하고 250rpm에서 진탕하면서 약 14시간 동안 성장시켰습니다.
   2. 새로운 배지로 하룻밤 사이에 박테리아 배양을 1:100 희석하여 S. aureus를 Subculture합니다. 37 °C에서 흔들어 배양합니다.
2. 배양된 박테리아 1mL를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 5,000×g으로 원심분리하여 중간 기하급수적 성장에 도달했을 때 S. aureus를 하반배양합니다.
   메모: 우리의 성장 조건에서 USA300 및 USA300ΔsaeR/S는 약 135분의 배양 후 중간 기하급수적 성장 단계에 도달했습니다.
3. 상층액을 흡인하고, 펠릿화된 박테리아를 1mL의 DPBS에 재현탁시키고, 샘플을 30초 동안 볼텍싱하고, 실온에서 5분 동안 5,000×g으로 원심분리하여 원심분리 후 S. aureus를 세척합니다.
4. DPBS로 희석된 20% 인간 혈청 1mL에 박테리아 펠릿을 재현탁시키고 37°C에서 15분 동안 교반하면서 배양하여 S. aureus를 Opsonize합니다.
5. 실온에서 5분 동안 5,000 x g의 박테리아를 원심분리기로 분리했습니다. 상층액을 흡입하고 펠릿화된 박테리아를 1mL DPBS로 재현탁시킨 다음 박테리아 펠릿이 완전히 분해될 때까지 샘플을 볼텍싱하고 추가로 30초 동안 원심분리 후 S. aureus를 세척합니다. 박테리아를 5,000 × g에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
6. opsonized S. aureus 균주를 1mL RPMI로 재현탁시키고 박테리아 펠릿이 완전히 분해될 때까지 샘플을 소용돌이친 다음 추가로 30초 동안 얼음 위에 박테리아를 놓습니다.
7. 얼음처럼 차가운 RPMI로 opsonized S. aureus 균주를 원하는 농도로 희석합니다. 30초 동안 소용돌이치고 얼음 위에 놓습니다.
8. 트립틱 대두 한천에 박테리아의 1:10 연속 희석액을 도금하여 opsonized S. aureus의 농도를 확인합니다.
   메모: 이 분석에 사용된 박테리아 농도의 차이는 후속 PMN 원형질막 투과성에 큰 영향을 미칠 수 있으므로(그림 1A), 테스트된 각 균주의 농도는 모든 실험에 대해 결정되고 균주 간에 동등해야 합니다.
9. 각 S. aureus 균주 100μL 또는 RPMI(양성 및 음성 대조군용)를 얼음 위의 96웰 플레이트의 PMN에 부드럽게 추가합니다. S. aureus를 우물에 분배하기 위해 부드럽게 암판을 만듭니다.
10. 4°C에서 8분 동안 500× g에서 플레이트를 원심분리하여 식세포작용을 동기화합니다. 원심분리 직후 37°C에서 플레이트를 배양합니다(T = 0).
11. 원하는 시간에 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 얼음 위에 올려 놓습니다. 40μL의 0.5% Triton X-100을 positive control well에 추가합니다.
12. 각 웰에서 샘플을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음 1μL의 프로피듐 요오드화물과 함께 200μL의 얼음처럼 차가운 DPBS가 포함된 얼음 위의 유세포 분석 튜브로 샘플을 옮깁니다.
13. 유세포 분석을 사용하여 프로피듐 요오드화물 염색을 위한 샘플을 분석합니다.
14. 유세포 분석을 사용하여 프로피듐 요오드화물 양성 PMN의 비율을 측정합니다. DNA에 결합할 때 요오드화 프로피듐은 535/617 nm에서 여기/방출을 갖습니다.

결과

그림 1: S. aureus의 식세포작용에 따른 PMN의 유세포 분석 분석. (A) USA300 또는 USA300∆saeR/S의 상이한 농도의 식세포작용 후 90분 후 프로피듐 요오드화물 양성 PMN의 비율.(B) 실험에 사용된 opsonized S. aureus 균주의 농도는 패널 A에 나와 있습니다. 데이터는 양측 t-검정에 의해 결정된 바와 같이 * p ≤ 0.01을 사용한 4개의 개별 실험의 평균 ± SEM으로 표시됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브(스냅 캡 포함)	폭스바겐	89000-044	세포 세척에 사용
12x75mm 배양 튜브	폭스바겐	60818-430	유세포 분석 튜브로 사용
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	폭스바겐	89039-656	디스펜싱 미디어용
Bacto Tryptic soy broth, 대두 카제인 다이제스트 배지	피셔사이언티픽	211823	세포 배양 성장용
Bright-Line 혈구계	시그마-알드리치	Z359629	세포 계수 장치
DPBS, 칼슘과 마그네슘이 함유된 1x(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)	코 닝	21-030-이력서	세포 세척에 사용
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어	Tel.: 17-1440-02	PMN 정제
Fisherbrand 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학 피펫	피셔사이언티픽	13-678-11E	흡입 액체용
Greiner CELLSTAR 96웰 플레이트	밀리포어 시그마	M0687	실험 샘플을 담기 위한 플레이트
OMICRON 주사기 필터	오미크론 사이언티픽	SFPV13R	상층액 여과용
프로피듐 요오드화물	써모피셔 사이언티픽	P3566	멤브레인 불침투성 DNA 염색
PYREX 브랜드 4980 삼각 플라스크	콜-파머	EW-34503-24	세포 배양 성장용
RPMI 1640, L-글루타민 제외 1X, 페놀 레드	코 닝	17-105-CV	세포를 재현하는 데 사용됩니다.
트리톤 X-100	시그마-알드리치	엑스100	Membrane integrity positive control (멤브레인 무결성 양성 제어)

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