동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 균주 및 배양 조건
참고: 이 연구에서는 M. tuberculosis 균주 CDC1551이 사용되었지만, 모든 M. tuberculosis 균주도 동일한 방식으로 사용될 수 있습니다.
- 37°C에서 M-OADC-TW(0.5% 글리세롤, 카탈라아제가 없는 10% 올레산 포도당 복합체, 0.05% Tween-80이 보충된 7H9 육수)에서 0.5(~ 0.2 x 107 집락 형성 단위 또는 CFU)의 OD600까지 박테리아를 성장시킵니다.
- 배양액을 M-OADC-TW(박테리아의 1:10 희석 시리즈)로 희석합니다. 박테리아의 희석액(10,5,10, 6, 10,7, 10,8)을 선택적 7H11 플레이트에 삼중으로 플레이트화하여 CFU를 측정할 수 있도록 합니다.
- 37 °C에서 4주 동안 또는 콜로니를 정확하게 계수할 수 있을 때까지 플레이트를 배양합니다.
- 박테리아 접종물을 8,534 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 얻습니다. 펠릿을 식염수 10mL(0.9% NaCl)로 한 번 세척하고 식염수 15mL(0.9% NaCl)에 펠릿을 다시 현탁합니다.
2. 매디슨 챔버를 이용한 마우스의 에어로졸 감염
- 생쥐가 일주일 동안 새로운 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
- 챔버에 넣기 전에 마우스의 무게를 잰다.
- 멀티탭에 세 개의 코드(메인 챔버 전원, 진공 펌프, 공기 압축기)를 순서대로 꽂습니다.
- 유리병의 나사를 조심스럽게 푸십시오. 유리병을 생물 안전 캐비닛으로 가져오고 15mL의 식염수(0.9% NaCl)에 현탁된 챌린지 접종물을 추가하여 폐에서 ~ 104 - 106 CFU의 박테리아를 달성합니다.
- 생물 안전 캐비닛에 있는 유리병의 뚜껑을 닫습니다. 용기를 분무기 장치에 부착하고 하단(흡입구) 끝이 용기의 유체 수준보다 약 1/4인치 낮도록 수직 스테인리스 스틸 튜브를 조정합니다.
- 실험에 필요한 모든 동물(챔버에는 최대 90마리의 쥐를 수용할 수 있음)을 챔버에 넣고 문의 모든 걸쇠를 닫습니다.
- 메인(룸) 공기 유량계를 확인하십시오. 플로트(볼)의 중심이 왼쪽 눈금에서 측정한 대로 약 50L/min인지 확인합니다.
- 챔버의 제어판에 있는 시작 버튼을 누릅니다. 압축기 공기 유량계(왼쪽의 작은 미터)를 통과하는 공기 유량을 저울에서 4L/min으로 설정합니다. 챌린지 접종물이 분무되고 있는지 육안으로 확인하십시오.
- 15분 후 제어판 전면에 빨간색 표시등이 나타나고 실행 종료를 나타내는 신호음이 울리면 제어판의 오른쪽 하단 모서리에 있는 재설정 버튼을 눌러 타이머를 재설정합니다.
- 챔버 도어에 있는 작은 빨간색 버튼을 누르고 있으면 진공 청소기가 해제됩니다.
- 방 문을 열고 동물들을 꺼냅니다. 쥐를 다시 우리에 넣습니다.
- 유리 분무기 용기를 제거하고 밀봉된 누출 방지 운송 용기에 넣습니다. 용기를 생물 안전 캐비닛 안에 넣고 챌린지 서스펜션을 지정된 폐기물 용기에 폐기합니다.
- 사용한 분무기 용기를 생물학적 위험 백에 넣고 오토클레이브로 운반하기 위해 백을 밀봉합니다.
- 감염 절차가 끝나면 완충된 페놀과 70% 에탄올을 챔버 내부에 분사하고 챔버를 10분 동안 그대로 둡니다.
- 그런 다음 접근 가능한 모든 내부 표면을 매우 철저히 닦습니다. 오염된 종이 타월 등은 모두 폐기하십시오. Biohazard 쓰레기통에. 쓰레기, 쓰레기통 및 사용한 분무기 용기를 고압증기멸균합니다.
- 이미징 시점까지 동물들을 격리실에 다시 눕힌다.
- 이미징 당일에는 보조 용기에 담긴 동물을 이미징 룸으로 옮깁니다.
3. 동물 마취
- 맞춤형 가스 마취 시스템을 사용하여 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
- 마취 장치 상단에 있는 두 개의 숯 필터 용기의 무게를 각각 잰다.
- 무게가 초기 무게보다 50g 높으면 새 캐니스터로 교체하십시오.
- 기화기 장치를 점검하여 절차에 충분한 이소플루란이 있는지 확인하십시오.
- 노즈콘 홀더를 이미징 챔버 내부에 놓습니다. 절차에 필요한 노즈콘 수를 놓고 나머지 구멍을 노즈콘 차단제로 밀봉합니다.
- 고압 실린더에서 산소 공급을 켜고 55psi로 설정합니다.
- 마취실 앞에 있는 배출 펌프를 켜고 8L/min으로 설정합니다.
- 마취실 앞에 있는 산소 토글을 켭니다.
- 마취 유도실로 가는 가스 흐름을 켜서 가스 흐름을 1.5L/min으로 설정합니다. 가스 흐름을 끕니다.
- 이미징 챔버로 가는 가스 흐름을 켜서 가스 흐름을 0.25L/min으로 설정하고 가스 흐름을 끕니다.
- 이소플루란 기화기를 켜고 2 - 2.5%로 설정합니다. 이소플루란 기화기의 다이얼을 돌려 실험에 사용되는 동물의 수와 체중에 따라 이소플루란 수치를 조정합니다(~20g 무게의 마우스의 경우 2 - 2.5%, 300g 무게의 기니피그의 경우 4%).
- 생쥐를 마취실에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 마취 유도 챔버로 가는 가스 흐름을 켭니다.
- 완전히 마취될 때까지 5 - 10분 동안 마우스를 마취 유도실에 그대로 두십시오.
- 생쥐가 마취되면 이미징하는 동안 눈을 보호하기 위해 눈에 광학 연고를 바르십시오.
- 이미징 절차 동안 마우스의 마취를 용이하게 하기 위해 마우스의 코가 콧방울 안에 놓이도록 마우스를 복부 또는 흉골 누운 자세로 놓습니다.
4. 리포터 효소 형광(REF) 이미징
- 복강내 주사로 기질(20 μM, 무게 2.5 μL/g)을 감염된 마우스와 대조군 마우스에 주입합니다. 마우스는 이미징 챔버 내부에서 1분 미만 동안 마취 상태에 있습니다.
- 이미징 시스템을 시작합니다.
- 초기화를 클릭하여 시스템을 초기화합니다. 온도 막대가 녹색으로 바뀔 때까지 기다립니다.
메모: 이미징 챔버는 이미징하는 동안 동물의 체온을 유지하기 위해 가열된 플랫폼으로 구성됩니다.
- 이미징 획득 설정의 경우 Fluorescent | 전체 동물에 대한 Trans-illumination 또는 폐 조직에 대한 Epi-illumination, Acquisition Control Panel의 구조 및 오버레이.
- 단일 마우스의 경우 Field of view(시야)를 B로 설정하고 lamp level(램프 레벨)을 high(높음)로 설정합니다.
- 노출 시간을 자동, 중간 비닝, f/stop의 경우 2 - 3, 745nm에서 여기 필터, 780nm에서 840nm까지 방출 필터로 설정합니다.
- 시퀀스 설정을 위해 Sequence Setup을 클릭하고 폐 영역에서 9 - 12개의 투과 조명 지점을 선택합니다.
- 이미지 획득을 위해 Acquire를 클릭합니다.
- 이미징 후 마우스를 케이지에 다시 놓습니다.
- 완전히 회복될 때까지 마우스를 모니터링하거나 실험 시점에서 이미징하는 경우 CFU를 정량화하기 위해 마우스를 희생합니다. 이미징 후 마우스의 웰빙을 모니터링하기 위해 수정된 Karnofsky 점수를 수행합니다.
